陈泉润，蒋玉芹，刘 鹏，谢蒂立

(1.电子科技大学医学院，四川 成都610054；2.四川省医学科学院·四川省人民医院老年心血管科，四川 成都610072)

动脉粥样硬化(AS)是一种以脂质稳态失调为特征的慢性血管炎症性疾病[1]。在AS形成过程中，循环中的单核细胞到内膜后分化成巨噬细胞，巨噬细胞再摄取大量改性脂蛋白，如氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后，转化为富脂泡沫细胞，这是早期AS病变的标志[2]。miRNAs是长度约为22 bp的小型内源性非编码RNA分子，充当转录后调节因子来调节靶基因的表达，从而介导细胞增殖、分化和代谢等生理病理过程[3,4]。Yébenes等[5]研究表明，抑制血管中miR-217可保护血管功能，缓解AS。Wang等[6]的研究表明，miR-224-3p在AS中低表达，miR-224-3p上调可减轻小鼠AS。肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员14(TNFSF14)在多种免疫细胞中高表达[7]。Yuan等[8]报道TNFSF14在冠心病患者中表达增加，并促进ox-LDL诱导的THP-1细胞的炎症反应和脂质代谢。本课题拟通过研究miR224-3p和TNFSF14的相互作用及在老年AS患者、动物和细胞模型中的表达，确定其在AS中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1主要试剂和仪器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基和12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)和ox-LDL购自美国Sigma-Aldrich；所有miRNA相关试剂，对照模拟物(miR-NC)、miR-224-3p模拟物(miR-224-3p)、对照抑制剂(in NC)、miR-224-3p抑制剂(in miR-224-3p)及对照miRNA agomir(ago-NC)、miR-224-3p agomir(ago-miR-224-3p)、对照 antago-miRNA、antago-miR-30a-5p及过表达对照质粒(pcDNA)、过表达TNFSF14质粒(TNFSF14)和TNFSF14双荧光素酶质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 3000试剂购自美国Invitrogen；TRIzol试剂、青霉素-链霉素、RIPA缓冲液、BCA蛋白质测定试剂盒和BeyoECL Plus购自上海碧云天公司；双荧光素酶报告分析系统 (北京Promega)；cDNA反转录试剂盒购自德国Fermentas；SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(大连宝生物公司)；一抗GAPDH、TNFSF14、清道夫受体(SR-A)、乙酰辅酶A乙酰转移酶1(ACAT1 )、脂肪生成基因(ACS)、PPARα和CPT-1及相应二抗购自美国SantaCruz公司；甘油三酯(TG酶法)测试盒和总胆固醇(TCH酶法)测试盒购自南京建成生物工程研究所。ABI 7900HT 快速实时 PCR 系统(美国Applied Biosystems)；Tanon 5500凝胶成像系统(上海天能公司)；Olympus BX50倒置荧光显微镜(日本Olympus)。

1.1.2临床样本 收集2019年6月至2020年6月在四川省人民医院心血管内科确诊的老年(年龄65～79岁)AS患者31例和健康志愿者18例血液标本(作为对照组)，用qRT-PCR和蛋白质免疫印迹的方法比较其中miR-224-3p和TNFSF14表达水平的变化。该研究得到了本院伦理委员会的批准，参与者已全部签署知情同意书。

1.1.3实验动物 30只8周龄雄性ApoE -/- 背景的C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK(京)2021-0011，并在12 h光照/黑暗循环下饲养在无菌环境中，可以自由获取食物和水，保持恒定的湿度 (55±5)% 和温度 (23±1)℃。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与处理 THP-1单核细胞(TIB-202，ATCC)在补充有10%FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中于37 ℃和5% CO2的加湿环境下培养。为了诱导单核细胞分化为巨噬细胞，用100 nmol/LPMA处理细胞24 h。然后，将巨噬细胞与50 μg/ml ox-LDL孵育48 h，形成泡沫细胞。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 3000 试剂将上述相关试剂转染至THP-1细胞，分别为miR-NC组、miR-224-3p组、in NC组、in miR-224-3p组、pcDNA组和TNFSF14组，对照组不进行转染，以验证转染效率及miR-224-3p和TNFSF14的靶向关系；随后分组为对照组、ox-LDL组、ox-LDL+miR-224-3p组、ox-LDL+TNFSF14组和ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p组，以检测过表达miR-224-3p和TNFSF14对ox-LDL处理的THP-1细胞中脂质代谢的影响。

1.2.2qRT-PCR检测基因表达 使用TRIzol 试剂从THP-1细胞中分离总RNA。使用cDNA反转录试剂盒将来自每个样品的约5 μg总RNA逆转录为第一链cDNA。然后，以cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒进行实时PCR反应，程序为95 ℃ 3 min；90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。使用2 -ΔΔCt方法计算相对表达量。引物序列如下：miR-224-3p 正向引物：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′，反向引物：5′-AAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′；U6 正向引物：5′-CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3′，反向引物：5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；TNFSF14正向引物: 5′-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3′，反向引物: 5′-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3′；GAPDH正向引物: 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3′。反向引物: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′

1.2.3蛋白质免疫印迹 将细胞或小鼠主动脉组织用RIPA缓冲液进行裂解。使用BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质浓度定量。随后，取等量蛋白质通过 SDS-PAGE电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后用相应抗体在4 ℃避光孵育过夜。然后，将膜与HRP标记的二抗在37 ℃孵育1 h。使用BeyoECL Plus观察蛋白质条带，使用Image J软件确定光密度值。

1.2.4双荧光素酶报告基因分析 在线数据库TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测miR-224-3p与TNFSF14之间的结合位点。THP-1细胞以每孔1×104个的密度接种在96孔板中。将TNFSF14 3′UTR WT或TNFSF14 3′UTR MUT和 miR-224-3p模拟物或miR-NC通过Lipofectamine 3000试剂共转染至THP-1细胞，48 h后使用双荧光素酶报告分析系统评估相对荧光素酶活性。

1.2.5油红O染色细胞 内脂滴经体外转染48 h后，THP-1细胞衍生的泡沫细胞在4%多聚甲醛溶液中固定5 min，然后用油红O工作溶液在37 ℃ 避光染色5 min，并用60%异丙醇脱色10 s。在倒置显微镜下(×200)对染色的细胞进行拍照。

1.2.6细胞内TG和TC检测 按照甘油三酯(TG酶法)测试盒和总胆固醇(TCH酶法)测试盒说明书操作测定THP-1细胞内TG和TC水平。

1.2.7动物实验[9]将小鼠随机分为HFD组、HFD+ago-NC组和HFD+ago-miR-224-3p组，每组10只。给予小鼠高脂饮食(HFD)(18%脂肪和1.25%胆固醇)12周以诱导AS，同时通过尾静脉分别注射PBS、ago-NC、ago-miR-224-3p，每3天一次。

1.2.8组织取材 12周后，小鼠禁食过夜并在清晨通过腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉。摘除眼球，取血后离心分离血清，-80 ℃保存。使用相应的试剂盒检测血清中TC和TG水平。然后打开胸腹腔，4%多聚甲醛灌流左心室30 min，仔细解剖心脏上部和近端主动脉，将主动脉纵向展开，用油红O染色，然后拍照，用Image-Pro Plus 7.0软件测定主动脉表面被油红O染色的病灶面积百分比。随后，提取小鼠主动脉总RNA，按照1.2.2 qRT-PCR操作检测基因表达。

1.2.9HE染色显示主动脉窦病变情况 取各组小鼠主动脉窦处组织样本，用O.C.T包埋剂包埋，石蜡切片脱蜡脱水后，苏木素染色5 min，再将玻片置于伊红染液中染色2 min，流水冲洗。常规脱水，透明，封片。光学显微镜下观察并拍照。

1.2.10油红O染色主动脉窦 主动脉窦组织经冰冻切片后，油红O染色10 min，50%异丙醇分化30 s，苏木素复染5 min，1%盐酸酒精分色1s，封片后光镜下观察并拍照。用Image-pro Plus 7.0软件检测主动脉窦油红O染色面积。

1.2.11Masson染色主动脉窦 组织经冰冻切片后，苏木素染色6 min，氨水返蓝，丽春红品红染色液染色3 min，磷钼酸分化3 min，苯胺蓝染色2 min，分化水洗，脱水，透明，封片。镜下观察并拍照。胶原纤维染成蓝色，肌组织染成红色。

1.3 统计学方法使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，所有数据均表示为3次独立实验的平均值±标准差。通过未配对的Student′st检验比较两组之间的差异，单因素方差分析用于比较多组之间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-224-3p和TNFSF14在体内和体外的表达与对照组(1.00 ± 0.02)比较，miR-224-3p在AS患者血清(0.41 ± 0.03)和ox-LDL诱导的THP-1细胞中(0.38 ± 0.04)的表达显著降低(P<0.05)，TNFSF14蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图1。

图1 miR-224-3p和TNFSF14在体内和体外的表达 a：蛋白质免疫印迹检测血清中TNFSF14蛋白的表达；b：蛋白质免疫印迹检测THP-1细胞中TNFSF14蛋白的表达

2.2 miR224-3p与TNFSF14的靶向关系TargetScan数据库分析发现miR-224-3p与TNFSF14的3′UTR序列结合(图2)。TNFSF14 3′UTR WT与miR-224-3p共转染至THP-1细胞明显降低相对荧光活性(P<0.05)，见表1。与对照组相比，miR-224-3p组TNFSF14蛋白表达下调，inmiR-224-3p组TNFSF14蛋白表达上调(P<0.05)。见表2。

图2 TargetScan数据库分析miR-224-3p与TNFSF14结合的序列

表1 荧光素酶活性实验验证miR-224-3p和TNFSF14的靶向关系

表2 各组THP-1细胞中miR-224-3p和TNFSF14表达水平的变化

2.3 过表达miR-224-3p和TNFSF14后THP-1细胞中脂质含量和脂质代谢相关蛋白表达的变化对照组、pcDNA组和TNFSF14组中TNFSF14 mRNA的相对表达量分别为(1.00 ± 0.04)、(0.97± 0.06)和(4.32 ± 0.27)，与对照组相比，TNFSF14组TNFSF14 mRNA表达显著上调(P<0.05)。与对照组相比，ox-LDL刺激后细胞内脂质积累显著增多；与ox-LDL组比较，ox-LDL+TNFSF14组细胞内脂脂质积累显著增多，而ox-LDL+miR-224-3p组细胞内脂质积累明显减少，见图3和表3。 ox-LDL组细胞中SR-A、ACAT1和ACS的表达较对照组显著上调(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表达显著下调；与ox-LDL组比较，ox-LDL+TNFSF14组细胞中SR-A、ACAT1和ACS的表达显著上调(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表达显著下调(P<0.05)，ox-LDL+miR-224-3p组细胞中各蛋白表达情况与之相反。 与ox-LDL+TNFSF14组比较，ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p组细胞内脂质积累显著减少(P<0.05)，SR-A、ACAT1和ACS的表达显著下调(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表达显著上调(P<0.05)。见表4。

图3 THP-1细胞中脂质累积图像 a：对照组；b：ox-LDL组；c：ox-LDL+miR-224-3p组；d：ox-LDL+TNFSF14组；e：ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p组(油红O染色，×200)

表3 各组THP-1细胞中的TC和TG含量变化

2.4 过表达miR-224-3p对ApoE-/-小鼠中脂质代谢相关蛋白表达的影响HFD组、HFD+ago-NC组、HFD+ago-miR-224-3p组小鼠主动脉中miR-224-3p表达量分别为(1.00 ± 0.03)、(0.98 ± 0.05)和(3.73 ± 0.18)，TNFSF14蛋白表达量分别为(0.54 ± 0.04)、(0.51 ± 0.06)和(0.22 ± 0.03)。与HFD组相比，HFD+miR-224-3p组小鼠主动脉中miR-224-3p的表达显著增加，TNFSF14蛋白表达显著下降(P<0.05，图4a)，TC和TG水平显著降低(P<0.05)，见表5。SR-A、ACAT1和ACS的表达明显下调，PPARα和CPT-1的表达显著上调(P<0.05)，见图4b。

表4 各组THP-1细胞中脂质代谢相关蛋白水平变化的比较

2.5 过表达miR-224-3p对ApoE-/-小鼠AS的影响与HFD组相比，HFD+ago-miR-224-3p组主动脉弓区域AS病变的数量、大小以及病变面积明显减少(P<0.05)。HE、油红O和Masson染色显示HFD+ago-miR-224-3p组病灶面积及脂质沉积显著减少，胶原蛋白含量显著增加(P<0.05)。见表6和图5。

表5 各组小鼠血清中TC和TG的含量变化

图4 过表达miR-224-3p对ApoE-/-小鼠中脂质代谢相关蛋白表达的影响a：蛋白质印迹检测TNFSF14蛋白表达；b：蛋白质印迹检测脂质代谢相关蛋白的表达(1：HFD组；2：HFD+ago-NC组；3.HFD+ago-miR-224-3p组)

表6 各组ApoE-/-小鼠AS病变比较

图5 过表达miR-224-3p对ApoE-/-小鼠AS的影响a：HFD喂养的Apo E -/-小鼠通过尾静脉注射PBS、ago-NC和ago-miR-224-3p处理后，立体显微镜下主动脉弓斑块(黄色箭头)(40×)；b：Apo E -/-小鼠主动脉大体标本(油红O染色)；c：Apo E -/-小鼠主动脉根部冷冻切片(HE、油红O或Masson染色(1：HFD组；2：HFD+ago-NC组；3.HFD+ago-miR-224-3p组)

3 讨论

最近的研究表明miR-224-3p在人类心血管疾病中发挥重要作用。例如，Dharma等[10]发现miR-224-3p与STEMI患者血管生成后冠脉微血管阻塞有关。Wang等[6]报道HDAC1通过去乙酰化增强miR-224-3p的表达，进而减少内皮细胞凋亡，产生抗AS作用。本研究观察到在AS患者中，miR-244-3p低表达，而TNFSF14高表达。THP-1细胞已被广泛用于脂质代谢相关的研究[11]。本研究结果显示在ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞中miR-244-3p 和TNFSF14表达结果与体内一致。miR-244-3p直接与TNFSF14 3′UTR结合来抑制TNFSF14的表达。

研究表明巨噬细胞在炎症和脂质沉积中起着关键作用，而炎症和脂质沉积是AS斑块形成和破裂的关键触发因素[12,13]。本研究结果显示，TNFSF14过表达显著增加了ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞内的脂滴，升高了细胞内TC和TG水平，并显著降低了脂肪分解基因的水平，增加了脂肪生成基因的表达。重要的是，miR-224-3p通过负性调节TNFSF14的表达减轻了巨噬细胞中的脂质积聚。富含胆固醇的脂蛋白(包括ox-LDL)主要通过细胞表面的如SR-A1被摄取到THP-1巨噬细胞中，并在泡沫细胞的形成中起重要作用[14]。ACAT-1是细胞胆固醇稳态和AS的关键酶[15]。

本研究发现miR-224-3p在高脂饮食喂养ApoE敲除小鼠体内明显下调TNFSF14的表达，并降低了血清TC和TG含量，同时显著增加了脂肪分解基因的水平，降低了脂肪生成基因的表达，与细胞培养实验结果一致。此外，HE、油红O和Masson染色显示miR-224-3p显著减少病灶面积并抑制脂质沉积，并显著增加胶原蛋白含量。因此，miR-224-3p通过降低TNFSF14的表达抑制脂质积聚，进而抑制ApoE敲除小鼠AS病变的发展。