李素廷 洪 莉 洪莎莎

武汉大学人民医院妇产科 湖北 武汉 430060

骨骼肌占人体总重的30%～40%，是调节机体代谢以及维持体内平衡的重要组织。骨骼肌损伤后可依赖组织驻留的肌卫星细胞（satellite cells，SCs）或通过细胞因子发挥直接或间接作用调节组织重塑［1］。初始炎症反应期、SCs 活化和增殖再生期以及再生肌纤维成熟重塑期是肌肉损伤后再生过程中的三个重要阶段［2］。骨骼肌在维持机体生命活动中有着无可替代的价值，在损伤过重或再生受损情况下肌肉功能难以达到有效修复，了解骨骼肌组织损伤及修复的动态过程，探寻维持肌肉再生的有效机制对于修复受损的肌肉组织具有重要价值。骨骼肌损伤的原因众多，包括机械力造成的肌肉撕裂和挫伤等直接创伤［3］、由年龄或慢性压力造成的间接损伤［4］，以及其他因素所致的肌肉病变如肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、炎性肌病、肌肉营养不良等［5⁃7］，选择合适的模型是深入探寻疾病发病机制的关键。本文通过综述骨骼肌损伤动物模型的构建方法，分析骨骼肌损伤后修复的调控机制，以为后续的研究提供参考。

1 肌肉损伤模型构建

不同的肌肉损伤方案可以干扰组织的损伤⁃再生平衡程度，甚至改变再生过程及结果。有研究显示Myf5 缺失小鼠在冷冻损伤后呈现再生表现，但是在心脏毒素（cardiotoxin，CTX）损伤后再生能力明显减弱［8］。因此，了解不同方案对肌肉组织的破坏机制以及骨骼肌在这些条件下不同的反应方式尤为重要。根据模型构建的时间差异，可分为急性损伤及慢性损伤两种类型。

1.1 急性肌肉损伤常用的急性肌肉损伤模型的构建方式包括CTX、虎蛇毒素（notexin，NTX）、氯化钡（BaCl2）、甘油等生物毒素或化学物品的肌肉注射［9⁃11］，冷冻、挤压、牵拉或针刺等急性机械性损伤以及电击伤等。CTX 注射是最为常用的造模手段。CTX 和NTX 是天然毒性蛋白质，能够抑制激酶C以及磷脂酶A（2PLA2）的活性，与肌膜上的受体结合并使膜产生破损，通透性小孔的存在导致肌纤维去极化以及大量的Ca2+内流，从而损害肌肉功能；注射后易扩散，能够在在整个损伤后修复过程中呈现出均匀的肌纤维再生。但是由于CTX/NTX 属于生物类毒素，其效果稳定性相比于化学合成物BaCl2差［12］。冷冻损伤也是较为常用的肌肉损伤造模方式，通过液氮预冷后的铁棒通过与暴露的肌肉组织直接接触造成损伤，产生缺乏活细胞的“死区”，以及构成再生细胞来源的远端保留区。相比毒素注射，冷冻损伤也会破坏脉管系统［12］，造成更为严重的SCs 损失。顿挫、牵拉伤在运动型损伤中的占比高达90%以上，钝器打击或自体/异物重量造成的顿挫撕裂损伤后的修复研究也具有一定的意义和价值［13］。电击损伤是基于不可逆的电穿孔原理进行，有效接受电击的组织能够完全受损但保持细胞外基质的完整，适用于特定研究中。机械性损伤的不足在于模型稳定性差，组织损伤不均匀，组织修复过程常涉及多种细胞的运动、相互作用。但在某些情况下，这种细胞由正常⁃损伤组织的定向迁移能力能为研究组织内不同群体的定向迁移和渗透提供便捷。

1.2 慢性肌肉损伤慢性肌肉损伤的研究常是以某些疾病为基础，如杜氏进行性肌营养不良（DMD）、ALS 等，其模型的多样性远不如急性肌肉损伤。Mdx 小鼠（dystrophin 缺失）是常用的慢性损伤动物模型，虽然Mdx 小鼠的肌肉功能受损程度弱于病人的表现，但是其骨骼肌处于较为频繁的损伤⁃修复过程中，是研究骨骼肌损伤修复的最有效模型之一。ALS 特征是运动神经元的变性和死亡导致骨骼肌失神经支配、萎缩，神经肌肉接头的功能障碍在ALS 的发作中起着至关重要的作用［14］。去神经支配造成的肌肉功能损伤也是研究肌肉退行性病变的有效模型之一，以肌肉萎缩以及骨骼肌组织纤维化为主要表现［15］，修复过程伴随着线粒体过氧化物、单胺氧化酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶等均呈现增加趋势［16］。

2 骨骼肌损伤后修复及调控相关因素

成人骨骼肌的组成主要是由终末分化的肌纤维组成，肌肉损伤后的修复主要由驻留于肌膜的静止状态的SCs 激活后重新进入细胞周期并参与肌纤维分化以完成修复或重建。肌肉功能的有效重建还需要其他肌肉组织中的细胞/因子调节，如纤维脂肪形成祖细胞（fibrocyte/adipocyte progenitors，FAPs）、内皮细胞、间充质干细胞、巨噬细胞等细胞成分，以及胰岛素样生长因子1（insulin⁃like growth factor⁃1，IGF⁃1）、转化生长因子⁃β1（transforming growth fac⁃tor⁃β1，TGF⁃β1）等细胞因子。

2.1 SCs 分化主导的肌纤维修复骨骼肌由肌纤维、神经元、脉管系统和结缔组织组成，其中骨骼肌的结构和功能单元为肌纤维，每个肌纤维被内膜（也称为基底膜或基底层）包围。SCs 处于肌纤维的质膜之间，位于周围的基底层下方和肌纤维质膜外侧，SCs 及同期有相互作用的周围环境被称为卫星细胞龛。SCs 在正常情况下大都处于静止状态，激活后重新进入细胞周期。在此过程中，肌纤维的从头合成分为两个阶段。第一阶段是成肌细胞间的相互融合形成新生肌管，第二阶段是新的成肌细胞融合到新生肌管中形成成熟肌纤维，表现为MyHC 以及其他肌肉收缩相关蛋白的表达增加。肌肉损伤后的修复过程受到关键转录因子如MyoD、MyoG、Myf5 等分子的调节，这些成分表达的时间及多少决定了SCs增殖与分化之间的平衡。尽管该肌肉损伤后修复过程中SCs 的作用已得到一定程度的阐释，但是探索决定SCs 内在数量及平衡的机制、了解调节肌肉肥大及萎缩的机制，从而对相关疾病或症状进行有效预防或治疗仍需要进一步研究解决。

2.2 FAPs 的调节存在于肌间质中，具有分化成成纤维细胞或脂肪细胞的特征，对SCs 的增殖以及终末分化有重要调控作用。FAPs 是促进细胞分化因子的来源之一，共培养实验表明FAPs 能够通过分泌某些因子驱动成肌细胞的分化和融合，并且能够抑制白喉毒素所致的肌肉再生受损［17］。此外衰老会损害FAPs 的功能，衰老小鼠骨骼肌的FAPs 中WNT1 诱导信号通路蛋白1（WISP1）丢失，年轻小鼠体内的FAP 移植或WISP1 添加治疗可恢复老年小鼠中SCs 的成肌能力，促进骨骼肌损伤后的再生修复［18］。FAPs 也是纤维化的主要来源，去神经引起骨骼肌组织中FAPs 的逐步积累，细胞表现出持续的STAT3 激活并分泌较高水平的IL⁃6，从而促进肌肉萎缩和纤维化。同时在小鼠脊髓损伤、脊髓性肌萎缩、ALS 患者的肌肉中发现了STAT3⁃IL⁃6信号异常激活的FAPs［19］。而在营养不良小鼠中，FAPs 能够分化成类似于成纤维细胞的基质生成细胞。因此，FAPs 在再生期间在肌肉生理学中发挥显著的调节和营养作用。

2.3 神经支配调控在周围神经系统中，有髓神经轴突自神经元胞体发出后，被施万细胞所组成的髓鞘包绕。施万细胞可通过分泌神经营养因子、细胞黏附分子等引导轴突生长锥的定向生长。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是神经营养因子中最早被发现、具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均有重要的调控作用。NGF 在发育中的肌肉中表达，并在再生受损的肌肉中再次升高，如肌营养不良症、ALS，提示NGF 的表达可能与肌肉再生有相关性［20，21］。与NGF 类似，成人骨骼肌中脑源性神经生长因子(BDNF)能够使SCs 保持其静止状态并防止其成肌分化，内源性BDNF 的减少会导致早期的肌源性分化。这些数据表明神经营养因子或同时能够以自分泌方式起作用，调节SCs 的行为和肌肉的再生。

2.4 免疫细胞的调节正常情况下骨骼肌中驻留的免疫细胞较少，在损伤发生的早期阶段，免疫细胞被快速募集。肌肉稳态和再生涉及多种免疫细胞的相互作用，中性粒细胞/单核细胞是组织损伤后首先招募的细胞，在损伤后3 h 内出现，它们通过分泌蛋白水解酶清除、吞噬坏死组织。巨噬细胞根据损伤后出现的时间可分为M1 与M2 两种类型，不同类型的巨噬细胞具有不同的免疫调节功能，最终对肌肉再生过程发挥调控功能［11］。在老年肌肉中SCs 周围的免疫细胞显示出功能缺陷，自由基产生、吞噬作用和趋化作用的能力降低，这在一定程度上导致了老年骨骼肌再生功能的下降。

3 总结及展望

骨骼肌再生过程涉及多种细胞的相互作用，具有不同特性的细胞亚群提供了在再生过程中不同的推动力。能够同SCs 直接相互作用其他因素，如局部其他间质细胞，血管及其相关的分泌因子也具有调节SCs 功能并影响肌肉再生的潜力。多年来骨骼肌一直用于再生干细胞生物学研究，但该领域仍然缺乏统一化的损伤和修复实验研究方案，由于模型或者取材时间的差异，不同实验室之间数据的可比较性稍差。尽管已有大量研究显示出有效的调节SCs 增殖、分化能力或者促进其移植后修复能力的结果，但是SCs 移植后的低存活率和自我更新能力以及受限的运动能力等问题仍未解决。设立标准化的骨骼肌疾病研究方案，开发SCs 更为有效的体外增殖以及体内移植方法，在此基础上深入研究SCs 活动和分化行为的内外调控机制，生物医学工程的发展有望通过这些技术缓解肌肉相关疾病的患病及治疗压力。