李 艳，王 建，辜刚凤

1.川北医学院(南充 637000)；2.雅安市人民医院(雅安 625000)

近年来，有不少关于认知障碍的研究，也出现了许多类别的动物血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)模型，如鼠、猪、狗、兔等[1-4]，其中最常见的是啮齿类动物模型。目前，对啮齿类动物神经行为学评价工具的研究已较成熟，如莫里斯水迷宫实验、放射臂迷宫实验、物体辨别实验等[5-7],但因其与非人灵长类动物解剖与病生机制差异较大，且习性等各方面均不同，上述方法对于恒河猴认知功能评估方面并不实用。啮齿类动物与人类有着千差万别，这导致啮齿类动物的研究成果运用于临床时受到了很大的限制。而非人灵长类动物与人类有着较多相似之处，一直以来被认为是最理想的动物模型，其中恒河猴模型运用频率较高。恒河猴属于猕猴类属，与人类祖先同源，其解剖和相关的病理生理机制都与人类极其相似[8]，制作恒河猴各类VCI动物模型对于后续的临床研究有较大的帮助，甚至有望揭示各类VCI的早期预警标志物,达到临床上早发现、早诊断、早治疗的目的，对于后续的临床药物研究也可提供较可靠的突破口。

目前有关恒河猴VCI模型认知功能评估方面的研究还较少，但恒河猴阿尔兹海默病及精神分裂症等药理学模型的认知功能评估研究有不少发现[9]，其中，应用频率较高的有延迟匹配样本任务(delay matching sample tasks,DMST)、延迟非匹配样本任务(delayed nonmatching-to-sample,DNMTS)，两者同属于空间延迟反应实验[10-14]，延迟响应测试(delayed response test,DR)、视空间配对关联学习任务(visuo-spatial paired-associates learning,vsPAL)、对象就地场景记忆任务、延迟识别跨度测试(delayed recognition span task,DRST))也较常用[15-18]；应用频率较少的有物体检索绕道任务(object retrieval detour task,ORD)、认知集转换任务、手指迷宫实验[19-21]；此外，还有一些根据上述实验原理转变而来的任务测试，例如数字歧视任务、逆向学习任务、声学歧视任务等[22-23]。本文对应用较广泛任务的具体实验方法及其优缺点进行综述。

1 空间延迟反应

1.1 DMST

设备：灵长类动物椅、显示器(cathode ray tube，CRT)(可选用带有鼠标的电脑显示器替代)。具体做法：测试时，使恒河猴坐在灵长类动物专用椅上，眼睛距离CRT屏幕前83 cm，在灰色屏幕上出现固定亮点时，使恒河猴按下按钮，固定点于800～1 020 ms的随机时间点消失，随后出现样本刺激，样本刺激呈现400 ms后消失，后延迟800、1 000或1 200 ms(3个延迟持续时间随机选择，避免恒河猴预计延迟间隔)。测试刺激(与样本刺激相同则匹配，不同则不匹配)呈现820 ms。如匹配，恒河猴需松开按钮。在该时间内松开则获得一滴果汁奖励。在预训练中，恒河猴必须在测试刺激消失后 800 ms内重按按钮才可获得奖励。为避免恒河猴过度训练导致神经发生变化，需在每次实验中随机生成一种新刺激。如果恒河猴过早或过晚松开按钮，实验将自动停止，3～4 s的实验等待期后再开始实验且无奖励，恒河猴对测试刺激的匹配正确率代表其记忆保持的程度。

如需对恒河猴长期记忆进行测试，则将测试刺激多样化，使其选择与样本刺激相匹配的刺激。训练恒河猴坐在灵长类动物椅上，并使其通过在计算机显示器上移动光标来执行多目标视觉延迟匹配样本任务。每个实验由4个连续阶段组成：实验开始(目标)、样品(图像呈现)、延迟(空白屏幕)和匹配(多图像呈现)阶段。恒河猴将计算机光标移动到屏幕中心的起始目标，然后由互联网随机生成的剪贴画组成的示例图像启动实验。将光标置于样本图像中(20～300 ms)，然后在样本和匹配之间插入1～30 s的可变延迟间隔，使屏幕空白。然后进行测试阶段,该阶段由2～6张图片组成，只有一张是样本图片；其他图像是不匹配或干扰图像。图像匹配正确，通过吸管向恒河猴输送0.5 mL的果汁作为奖励。所有图像(样本、匹配和干扰项)随机呈现在显示屏上的9个位置之一；在匹配阶段，匹配图像不放置在与样本图像相同的位置。每轮大约有500～600张独特的图像，均是从5 000个不同的剪贴画图像中随机选择。每3～10 s进行1次实验，每轮共进行150～200 次实验[24-26]。

DMST评估方式是恒河猴众多认知评估方式中使用最多的一种。根据延迟反应实验原理,DMST可使用多种形式进行，实验中所使用的仪器及器材均可根据实验室所处环境及经济实力等条件进行实时调整，实验原理易理解，且操作简单，训练员易掌握，且实验预训练及正式训练所需时间较短。由以往实验员的经验可知，该实验所需时间周期比其他实验方式具有独特的优势，且在恒河猴身上能顺利开展，训练成功率较高，在其他条件达到的情况下，动物依从性较好。该评估方式是目前最理想的认知评估工具之一。不仅可通过上述动物的视觉对其认知功能进行评估，还可通过触觉、听觉进行评估，其中，触觉主要起评估长期记忆的作用，而听觉延迟匹配样本任务主要评估动物的短期记忆。DMST已经得到认可，但使用该方法进行评估时，所用时间十分精确，较难把握，且需根据恒河猴种类及不同生活习性进行合适的调整。

1.2 DNMS

设备：测试托盘、合适的样本对象与测试对象、计时器。具体做法：DNMS是一种视觉识别记忆测试，在手动装置中进行。简言之，向恒河猴展示一个样本对象，该对象覆盖测试托盘中央孔中的食物奖励，当恒河猴取回食物后，延迟期开始，在此期间降低不透明挡板。在延迟期后，样本对象与新对象一同呈现，恒河猴选择新对象则获得奖励。在恒河猴获得奖励后，保留间隔设置为10 s，直到恒河猴学会该任务的不匹配规则。一旦恒河猴在这个延迟间隔(100次实验，20次/d)达到90%或以上正确率，就会通过连续施加15、30、60、120 s(100次实验，20次/d)、600 s(总共50次实验，5次/d)的更长延迟间隔来挑战识别记忆。在整个测试过程中，实验间隔为30 s[27]。

DNMS与DMS原理相同，操作方式相反，也可根据实验环境及其他条件实时调整仪器及器材。虽该方式所用时间较易控制，但该评估工具相比延迟匹配样本任务使用率低，其主要原因在于该工具预实验所需训练时间长，实验周期长，一般训练周期长达12个月。若实验对象依从性不好，则需更长时间对其进行训练，因此，该方法一般不作为首选认知评估工具。

2 DR

设备：透明/不透明屏幕、食物槽、食物、计时器。具体做法：DR与之前研究中使用的方法等效。恒河猴从透明屏幕后面观看，同时装置的一个槽被食物填充，然后两个槽都被掩体覆盖。在初始训练期间，屏幕会立即升起，如果选择了正确的位置，恒河猴就可移动掩体并取回食物。测试一直持续到动物达到90%或以上正确率为止。下一阶段，在填充好食物和恒河猴响应间强加了1 s保留间隔。通过降低不透明屏幕来实现延迟，使恒河猴看不到食物槽。延迟1 s的训练持续到恒河猴达到标准(在90次实验中正确率达90%)，然后通过连续施加5、10、15、30、60 s的较长保留间隔，对记忆的要求逐渐变得困难。每个延迟测试总共90次实验(30次/d；实验间隔20 s)[28]。

DR在早年的猴认知功能评估中使用较多，该实验原理最初被用于老鼠的认知功能评估，后经过改造用于恒河猴。目前，该评估方式使用次数相对较少，但仍是一种较可靠的恒河猴认知功能评估方式。DR操作简单，实验流程容易理解，所采用的时间单位较易掌握，但是否适用于当前所饲养的恒河猴还取决于动物种类及配合程度，即恒河猴对该任务的依从性。

3 vsPLA

设备：专业电脑显示屏、计时器。具体做法：vsPAL中，恒河猴被训练使用1组6对(12个)视觉刺激来执行任务。在每次实验中，1个注视点呈现 0.8 s，之后提示刺激(12个视觉刺激之一)呈现 1 s。在 2.2 s的延迟期后，出现两种刺激(提示刺激的配对关联物和干扰物)。恒河猴在 1.5 s内正确选择配对关联物则获得奖励。在这个任务中，恒河猴不需选择刺激本身，而是选择与之配对的关联物，因此，完成任务需要回忆，而不是识别,直到正确率>90%。如果在延迟期结束前眼位偏离注视点超过1.5～2.0 s，则实验自动终止[29]。

vsPAL最初常用于对啮齿类动物的神经行为学进行评估[30]，其与对象就地场景记忆任务不同，主要测试的不是恒河猴识别新事物的能力，而是测试其回忆旧事物的能力。该任务需实时监测恒河猴的眼球运动方向来判断恒河猴的注意力变化过程，使用仪器包括能实时监测眼球运动的红外线眼部监测器。该评估方式是除延迟匹配样本任务外使用频率最高的任务，其测试认知功能的效能得到了许多研究员的认可。若条件允许，该实验不失为一种较理想的恒河猴认知功能评估评价工具。

4 对象就地场景记忆任务

设备：带有触摸屏的视频显示器、漏斗、食物盒。具体做法：每次实验显示屏中场景均由人工自制。每个场景中有两个前景对象，由随机的彩色字符组成，每个字符都被放置在单个场景中的固定位置,其中之一是正确的(恒河猴触摸可奖励)，另一个是错误的(恒河猴触摸无奖励)。使用随机生成器生成每个独特场景的背景，即屏幕的背景颜色、字符位置、颜色、大小和方向、干扰字符(在大小上明显不同于前景对象)和字符颜色随机变化。所有的颜色有一个限制条件，即与前景对象可区分。由于这些场景是随机生成的，所以可呈现无数个独特场景。在每只恒河猴学会在黑色背景下触摸单个前景物体后，在程序中引入额外的场景，直到恒河猴在面对新的场景时较准确地触摸前景物体。然后引入两个前景物体，每个阶段给出的场景数量会根据每只恒河猴的表现逐渐增加。点击正确的物体将使该字符闪烁2 s，然后消失，奖励便会被送到漏斗中。当恒河猴触摸到错误对象时，屏幕立即变成空白，恒河猴也获得奖励，并间隔10 s。触摸场景中的其他任何地方都会导致屏幕空白，然后重复实验。恒河猴通过试错来学习每个场景中的正确物体。因为在第2次重复时错误率较低，所以在第1次浏览时非常快。当恒河猴完成最后1次实验时，午餐盒自动打开，恒河猴获得大量食物奖励。如果实验错误，就会进行纠正实验，这样恒河猴只有在正确回答后才会得到大量食物奖励。同时记录下20个场景中每个重复块选择错误次数(初始接触不正确前景对象)。训练持续进行，直到表现稳定[31]。

对象就地场景记忆任务又称为新物体识别实验，最初该任务也主要用于老鼠的认知功能评估，后经改造用于恒河猴，目前还有不少恒河猴阿尔兹海默症及精神性疾病的药理学实验用该任务对其实验模型进行评价。该任务相比其他任务所需采用的仪器更繁杂，种类较多，对于条件一般的实验基地难以达到既定的标准。该任务需人工设定场景，所使用的触摸显示屏较难获得，且步骤较多，虽可对恒河猴认知功能进行评估，但因实验本身的复杂性，恒河猴学习周期可能较长，需花大量时间对其进行训练，相比其他周期较短的任务，该测试方式并无太多独特的优势。

5 DRST

设备：棕色圆盘、不同规格测试托盘、不透明挡板。具体做法：在DRST测试中，刺激物为直径约4 cm的棕色圆盘。随着实验次数增多，恒河猴必须在一个实验中的不同位置上根据刺激物出现的不同顺序，区分出新位置的刺激。测试托盘由18个(3×6)食物槽组成。将食物放入槽中用圆盘覆盖时，测试开始，恒河猴可移动圆盘来获取食物奖励。挡板在实验者和恒河猴间隔10 s，在此期间实验者更换原始位置的圆盘，并在不同位置添加新圆盘(下方有奖励)。然后屏幕升起，恒河猴必须置换新的圆盘才能获得奖励。在每次正确响应后，添加额外的圆盘，直到恒河猴犯错或恒河猴连续9次选择正确圆盘。任务包括新的和重复的两种序列类型。对于新序列，刺激物随机放置于托盘上18个食物槽。实验10次/d，共10 d(100次实验，包括75个新序列和25个重复序列)。恒河猴在犯错前正确选择次数均数称为空间记忆跨度。新序列和重复序列的分数分别计算[32]。

该实验中新序列的出现主要用于评估恒河猴工作记忆。对于重复序列，圆盘以独特的顺序出现在托盘上，该顺序在实验中重复，让恒河猴记住。除了第1个刺激的初始位置外，没有其他线索与该序列关联，这些实验用于评估恒河猴参考记忆，因为其提供的信息与实验相关。DRST与对象就地场景记忆任务原理相同，对象就地场景记忆任务主要是识别新的物体，而DRST主要是测试恒河猴识别新位置的能力，其常与DMS、DNMS联合进行。该任务操作较简单，易于理解，实验周期较适中，从时间成本看，较DNMS有很大的优势，且实验器材可根据实际情况做调整与改进，并根据当地恒河猴的性格及依从性进行设定。目前还未有一种聚集性的实验对上述6种认知评估方案进行比较分析，认知评估方式选择仍需结合各实验基地实际情况进行。

6 总结与展望

空间延迟反应实验中的DMST是最理想的认知评估方案，且是目前使用范围最广，频率最高的方案，其弹性较好，可根据实际情况对该方案的形式与做法进行调整与改进[33]。如需对恒河猴认知功能进一步评价，应综合考虑实验对象依从性、实验任务复杂程度、实验装置可获取性、预训练时长、测试时长、实验结果可分析性，实验条件及可达到的最优化条件等，此时，DR[34-35]、DRST[36-37]也是不错的选择。相反，DNMS[38]、vsPAL[39-40]、对象就地场景记忆任务[41-42]在应用时有一定的局限，但最终认知功能评价工具的选择还需结合自身实验条件及实验动物的依从性进行取舍。ORD、认知集转换任务、手指迷宫实验等认知评估工具的效用及推广度还有待进一步商榷；此外，还有一些根据上述实验原理转变而来的大量任务测试，例如数字歧视任务、声学歧视任务、学习记忆颜色歧视任务[43]、延迟频率鉴别任务[44]、黑白歧视任务[45]、奖励任务[46]、视觉辨别任务[47]等。上述实验由于使用频率较低,且结果真实性有待商榷，还需后续大量实验对其结果进行验证。动物认知功能评估工具多种多样，恒河猴认知功能的评估方式也逐渐多样化，因此应根据实验目的，结合自身条件，选择合适的VCI恒河猴模型神经行为学评估工具。