张 鹏 张松林

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 胸心外科， 湖北 宜昌 443003)

心脏移植是终末期心衰的有效治疗手段，心脏移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy，CAV)是心脏移植术后死亡的主要原因[1]。CAV是免疫和非免疫因素介导的动脉内膜弥漫性圆周样增厚病变[2]，包括炎症细胞的浸润、平滑肌细胞的增殖迁移及纤维化病变，最终可导致动脉管腔闭塞、移植物功能丧失[3]。尽管免疫抑制剂的功效不断完善，CAV的发生率仍未显著下降[1]，目前主要针对可变的免疫和非免疫因素进行靶点治疗[4]。高迁移率族(high mobility group，HMG)蛋白是一种高度保守的核蛋白，广泛分布于哺乳动物细胞，在促进晚期炎症反应中发挥重要作用。其蛋白家族有三个超家族分子，每个超家族分子都含有一个特定功能结构域：HMGA包括HMGA1、2；HMGB包括同源功能蛋白HMGB1、2、3和4；HMGN包括HMGN1、2、3和4等。其中HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，包括2个富含赖氨酸的DNA结合域，A盒和B盒，以及一个特殊C端酸性尾部，主要由天冬氨酸和谷氨酸残基组成[5]。HMGB1作为核小体的组成部分，生理状态下具有维持核小体稳定、DNA的错配与修复、调节基因转录等功能[6]；病理状态下在免疫和炎症调节、细胞的迁移和分化中具有重要作用[7-8]。本文将对HMGB1在CAV发生发展中的作用进行综述，以期为延长移植物存活时间提供潜在治疗靶点。

1 HMGB1的诱导因素

1.1 高血糖

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在高糖诱导下，HMGB1表达水平显著增加，同时核因子κB p65转位增加，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平也相应增高，从而导致VSMCs增殖和迁移增加 。既往研究发现，HMGB1是microRNA-24的靶基因，VSMCs中过表达miR-24可显著拮抗HMGB1的表达，抑制高糖诱导下VSMCs的增殖和迁移[9]。此外，在冠心病患者中，HMGB1与TNF-α、IL-6的水平呈正相关，且HMGB1是非糖尿病冠心病患者的独立危险因素之一，血清HMGB1水平与2型糖尿病患者的冠脉病变严重程度密切相关[10]。

1.2 高血压

在离体人主动脉VSMCs中，血管紧张素Ⅱ可诱导HMGB1 mRNA和蛋白高表达，而血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker，ARB)氯沙坦则抑制了其诱导效应；在临床研究中，与健康对照组相比，高血压患者血浆中的HMGB1水平明显提高，且HMGB1血浆水平与患者收缩压和舒张压水平呈显著正相关[11]。在大鼠肺动脉高压模型中，肺组织内血管上皮细胞、平滑肌细胞和招募的炎症细胞均发现胞质转移的HMGB1，且HMGB1抑制剂甘草甜素能减轻肺动脉高压，减少肺血管重塑和右心室肥厚[12]。以上研究表明，HMGB1参与了高血压的血管病理重塑过程。

1.3 高血脂

高脂饮食可诱导载脂蛋白E敲除小鼠动脉血管壁损伤，且动脉损伤部位HMGB1表达丰富；与诱导组相比，抗HMGB1中和抗体处理组血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表达减少，巨噬细胞聚集和平滑肌细胞增殖受抑，动脉局部损伤程度减轻[13]。相同诱导模型中，小鼠血清HMGB1 mRNA和蛋白表达增加，而在HMGB1抑制剂甘草甜素作用下， IL-10和IL-2表达增加，IL-17A和IL-6水平降低，动脉管壁损伤面积减小[14]。

1.4 低氧与缺血

离体大鼠胸主动脉VSMCs给予低氧处理，培养液上清中HMGB1水平随时间延长而增加，钙拮抗剂尼莫地平可减少低氧诱导的VSMCs中HMGB1分泌[15]。在小鼠气管异位移植中，移植物在4 h冷缺血处理后，HMGB1从胞核转移到胞质中，说明缺血可诱导细胞损伤并伴随HMGB1被动释放[16]。另有异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌缺血模型中，HMGB1在缺血心肌组织中显著增加，且HMGB1可通过与TLR4(toll-like receptor 4，TLR4)受体结合进一步介导心肌缺血性损伤[17]。

2 HMGB1与缺血再灌注损伤

2.1 心肌损伤

实质器官移植会发生缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury，IRI)，HMGB1作为促炎因子，在IRI中发挥重要作用[18]。在大鼠冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD) 结扎30 min，再灌注180 min的IRI模型中，血浆肌酸激酶同工酶和肌钙蛋白(cTnI)浓度升高，光镜下大鼠心肌细胞变性、形态结构紊乱，间质中大量炎性细胞浸润，血浆HMGB1、IL-6和TNF-α浓度均升高，经HMGB1特异性抗体处理后，IRI炎症反应减轻，心肌组织损伤得到改善[19]。

2.2 细胞凋亡

Ding等[20]研究发现，阻断小鼠左前降支30 min，继而再灌注6 h后，心肌中HMGB1蛋白和TNF-α mRNA的表达量明显增加，并伴随心肌细胞凋亡及梗死灶形成；而在TLR4基因突变的小鼠组中，HMGB1和TNF-α的表达量均降低，细胞凋亡指数和组织梗死面积也明显减少。上述结果表明HMGB1-TLR4轴在心肌缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡中具有重要作用。

2.3 MicroRNA调控

Yao等[21]采用同基因小鼠心脏颈部异位移植，继而冷藏8 h，再灌注24 h建立了小鼠心肌IRI模型，发现移植物组织中miR-26a表达明显减少，HMGB1表达明显增加；过表达miR-26a后，HMGB1表达明显下降，炎症细胞浸润及细胞凋亡减少，且重组HMGB1处理后可逆转miR-26a的效应，说明miR-26a依赖于HMGB1途径缓解心肌IRI。此外，心肌细胞在缺氧/复氧处理后，miR-142-3p和miR-25减少，并伴随细胞凋亡和纤维化；上调miR-142-3p或miR-25均可逆转细胞凋亡，其作用靶点为HMGB1[22-23]。Xie等[24]同样发现，miR-451可通过负向调控HMGB1，拮抗心肌细胞凋亡。由此可见，miR-142-3p、miR-25和miR-451皆通过靶向抑制HMGB1而拮抗心肌缺氧/复氧损伤。

3 HMGB1与急性/慢性排斥反应

3.1 TLRs和 RAGE受体

HMGB1的受体Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)和晚期糖基化终末产物在炎症/应激反应及移植排斥中具有重要作用[8, 25]。在研究TLR2 和TLR4及其适配器蛋白髓样分化分子(myeloid differentiation factor, MyD)和β干扰素TIR结构域的小鼠肾移植排斥反应中，TLR内源性配体(包括HMGB1)在移植后42天表达均增加；而在TLR2、TLR4、TLR2/4、MyD88或TRIF基因缺乏的小鼠中，移植物的血管排斥、病理损伤均明显改善；在TLR2/4和MyD88缺乏的肾小管间质中CD4+T细胞数量明显减少，肾小球中CD8+T细胞在TRIF组减少更显著；而巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell, DC)在所有基因缺乏组中均明显减少；且TLR缺乏可明显改善移植物纤维化水平，降低肌成纤维细胞阳性数量和胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ的表达[26]。在大鼠小肠移植和小鼠肺移植模型中，RAGE基因缺失可明显减轻移植物炎症反应，缓解排斥损伤和改善移植物功能[27-28]。以上说明HMGB1介导的TLRs和 RAGE信号转导可明显促进移植排斥反应。

3.2 树突状细胞

DC作为抗原提呈细胞在移植排斥中可被激活。主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ不匹配的小鼠心脏腹腔移植模型可成功诱导移植物慢性排斥反应。HMGB1抗体处理后，可减轻新生内膜增厚和纤维化。HMGB1拮抗剂可减弱DC、CD80+、CD86+和MHC-Ⅱ+DCs的数量比例，抑制DC细胞的成熟。重组HMGB1可诱导小鼠骨髓源DC细胞(bone marrow dendritic cells，BMDCs)扩增及CD11c+细胞数量增高，并能促进CD4+T细胞、IL-17和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)含量增加，说明HMGB1可独立诱导DC细胞成熟，成熟的DC可驱使供体反应性Th17和Th1细胞应答，从而在慢性排斥中发挥作用[29]。黄亚非[30]在小鼠心脏腹部移植模型中发现，术后第7天HMGB1、TNF-α和IFN-γ表达显著上升； HMGB1特异性拮抗剂GST-A box可明显抑制炎症因子表达，下调脾脏DC表达CD80；在体外培养的BMDCs中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可刺激DC细胞中HMGB1的胞浆转位，促进同种异基因T细胞增殖；GST-A box可通过抑制DC细胞成熟和T细胞增殖，延长移植心脏的存活时间。上述结果表明，HMGB1可诱导DC细胞成熟，介导移植物的免疫排斥反应。

3.3 T细胞亚群

小鼠心脏移植后第3天，脾脏中CD4+和CD8+T细胞高应答，并伴随心肌组织中IL-17和IL-6同时升高。移植后1～7天，CD4+和CD8+T细胞中持续释放IFN-γ，并伴随HMGB1高表达，诱导心脏移植早期(第3天)中性粒细胞的浸润和晚期(第7天)单核细胞的增加。阻断HMGB1可抑制Th17应答，降低IL-6、IL-17水平，减少中性粒细胞浸润，明显延长移植物的存活时间[31]。上述研究表明，HMGB1诱导了产IL-17同种异体反应性T细胞介导的早期急性排斥反应，而产IFN-γ同种异体反应性Th1细胞则在Th17反应减弱后引起了移植物损伤。另有研究发现，HMGB1可诱导DC细胞分泌IL-23和IL-1β，并促进γδT细胞产生IL-17；阻断HMGB1可减少IL-23和IL-1β基因转录，抑制γδT细胞产生IL-17；γδT细胞缺失可降低血清IL-17水平，延长移植物的存活时间[32]。以上表明，HMGB1可通过诱导DC分泌IL-23和IL-1β，并刺激γδT细胞应答，参与移植物早期急性排斥反应。

3.4 B细胞

在大鼠/小鼠心脏异种移植中，HMGB1可从供体心肌细胞和受体来源的炎症细胞中释放。抗HMGB1抗体处理的第6天，移植心脏中的HMGB1、TLR4和RAGE受体表达量均明显降低，心肌细胞凋亡减少。在延长移植物存活时间过程中，CD20+B细胞浸润受到抑制，且大鼠血浆和组织中IgG和IgM抗体水平均明显下降，CD19+B细胞的MHC-Ⅱ在移植第6天表达也减少[33]。这表明在异种排斥反应中，下调HMGB1可抑制B细胞应答，延长移植物存活时间。

4 HMGB1与VSMCs

4.1 VSMCs的激活

离体大鼠胸主动脉VSMCs中，血管紧张素Ⅱ可诱导HMGB1释放，并伴随VSMCs增殖和迁移增加。在HMGB1抑制剂甘草甜素作用下，VSMCs增殖、迁移和表型转变明显受抑，且阻断HMGB1可明显减少血管新生内膜面积[34]。其机制可能与下调HMGB1拮抗Notch信号通路活化有关[34]。因此，HMGB1参与VSMCs的激活和血管新生内膜的形成。

4.2 VSMCs的迁移

HMGB1可呈剂量依赖性促进VSMCs迁移。杨简等[35]研究表明，HMGB1在100 ng/mL时VSMCs迁移效率最大，且能促进磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的活性和蛋白激酶B(Akt)的磷酸化；TLR4小干扰RNA和PI3K抑制剂处理后，VSMCs迁移显著受抑，Akt磷酸化水平下降。此研究表明，HMGB1介导的VSMCs迁移可能与TLR4/PI3K/Akt信号通路激活相关。冠心病患者血清HMGB1水平与IL-6呈正相关。Lee等[36]研究发现，HMGB1诱导IL-6分泌和VSMCs迁移依赖于丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)P38、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)的活化。

4.3 VSMCs的表型转变

IFN-γ可诱导VSMCs中HMGB1从胞核向胞质转移，沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1，SIRT1)可负向调控HMGB1在VSMCs胞质中的表达，拮抗IFN-γ诱导的VSMCs从收缩型向合成型转变[37]。

5 总结

目前并无特效药物能治疗CAV，在应用免疫抑制剂的基础上(其本身副作用也是CAV的发展因素)，高血压、高血糖和高血脂作为基础危险因素同样参与了HMGB1介导的血管损伤。HMGB1作为损伤相关分子模式的一员可从坏死/损伤的细胞中被动释放，也可在激活的免疫细胞如巨噬细胞、DCs和NK细胞中主动释放，对IRI和急性/慢性移植排斥反应均有促进作用。CAV中VSMCs激活在促进血管新生内膜形成和血管闭塞中起重要作用，阻断HMGB1可抑制VSMCs迁移和细胞表型转变，缓解急性/慢性移植排斥反应，从而延长移植物存活时间。可见HMGB1在不同信号途径下参与了CAV病理损伤过程，HMGB1阻断可延缓CAV进展，但却不能完全抑制CAV的发生发展，说明CAV是由多因素介导的，而HMGB1在其中发挥重要作用，可为CAV提供一个潜在的治疗靶点。