郑 旭，赵文静，缪美华，刘兴满

（连云港市农业科学院，江苏连云港 222006）

乌桕属大戟科（Euphorbiaceae）多年生高大落叶乔木，在我国栽培和利用历史已有1000 多年，广泛分布于黄河流域以南各地区[1-2]。乌桕是集能源、药用、材用、观赏于一体的多用途树种，具有较高的经济价值、推广应用价值。此外，乌桕树冠高大整齐，叶色秀丽，秋叶深红、紫红或金黄，可用于行道树、园景树，也可孤植、丛植或列植于广场绿地或森林公园的池畔、水旁等地方，形成良好的观赏效果[3]。

类黄酮属于植物次生代谢产物，是一类多酚类化合物。目前植物界鉴定出的类黄酮物质超过8000 种，依据结构上的差异可以分为黄酮类、黄酮醇类、花色素苷类、黄烷酮类等[4-5]。目前关于乌桕皮油和梓油等资源开发利用[6-8]、抗逆机理[9]、繁育[10-12]、遗传学[13-15]等方面研究较多，但乌桕秋叶色类黄酮成分及其含量变化的报道较少。本研究以‘连桕1 号’‘云台红桕’和‘云台金桕’为研究对象，利用超高效液相色谱-质谱联用技术，分析乌桕叶片中类黄酮成分及其含量，研究其类黄酮成分的差异及转色前后变化特征，为乌桕观赏品种选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以‘连桕1 号’‘云台红桕’‘云台金桕’为研究品种，分别选择3 株树龄12 年、生长健壮、长势一致、秋季转色后叶色分别为紫红色、鲜红色和金黄色的植株，于2021 年9 月14 日、11 月10 日10：00 取样2 次，重复3 次，选取树冠中部相同部位叶片。材料来源于连云港市农业科学院东辛实验基地乌桕种质资源库。

1.2 方法

1.2.1 定性分析。用2 mL 70%v/v 甲醇水溶液提取约100 mg 植物材料样品，每次使用超声波提取30min，共2 h，并在35℃的旋转蒸发器上减压，将混合提取物浓缩至几乎干燥。在分析之前，将残余物溶解在200μL 50%甲醇溶液中，并转移到配有插入装置的小瓶内。

利用超高效液相色谱（Vanquish，UPLC，Thermo,USA）和高分辨质谱（Q Exactive，Thermo，USA）联用技术对乌桕叶片中类黄酮成分进行定性与定量分析。色谱柱：Waters HSS T3（50×2.1mm，1.8μm）；流动相：A相为超纯水（含0.1%甲酸），B 相为乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；柱温40℃；进样量2μL；洗脱梯度：0min 水/乙腈（90∶10 V/V），2.0min 水/乙腈（90∶10V/V），6.0 min 水/乙腈（40∶60 V/V），9.0min 水/乙腈（40 ∶60V/V），9.1min 水/ 乙 腈（90 ∶10V/V），12.0min 水/乙腈（90∶10V/V）。采用电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI），鞘气40 arb；辅助气10 arb；离子喷雾电压-2800 V；温度350℃；离子传输管温度320 ℃。扫描模式为单离子检测（SIM）模式；扫描方式为负离子。

1.2.2 定量分析。标准品儿茶素、二氢杨梅素、表儿茶素、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氢槲皮素、槲皮苷、二氢山奈酚、木犀草素、槲皮素、柚皮苷查尔酮、柚皮素和山奈酚购于sigma公司，所有标准品纯度≥98%。建立儿茶素、二氢杨梅素、表儿茶素、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氢槲皮素、槲皮苷、二氢山奈酚、木犀草素、槲皮素、柚皮苷查尔酮、柚皮素和山奈酚13 种类黄酮标准曲线进行定量计算（表1），重复3次，计算各成分含量。

表1 13 种类黄酮标准曲线

2 结果分析

2.1 3 个乌桕品种叶片类黄酮鉴定

利用液相色谱-质谱联用技术对3个乌桕品种秋叶类黄酮成分进行定性分析，根据各成分保留时间、预期分子量和检测分子量，结合标准品和样品总离子流图，对其主要成分进行结构鉴定，共检测到13 种类黄酮成分（表2），分别是儿茶素（289.0718）、二氢杨梅素（319.0463）、表儿茶素（289.0722）、芦丁（609.1471）、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷（463.0885）、二氢槲皮素（303.0499）、槲皮苷（447.0932）、二氢山奈酚（287.0563）、木犀草素（285.0407）、槲皮素（301.0348）、柚皮苷查尔酮（271.1611）、柚皮素（271.0611）和山奈酚（285.0408）。

图1 类黄酮标准品的总离子流图

表2 3 种乌桕叶类黄酮质谱数据

图2 样品类黄酮总离子色谱图

2.2 3 个乌桕品种叶片类黄酮含量

由表3 可知，叶片转色前，‘连桕1 号’中叶片类黄酮含量占其类黄酮总量1%以上（含1%）的主体成分共5 种，其中槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁分别占57.12%、27.79% 和10.022%，合 计94.932%。‘云台红桕’中类黄酮含量1%以上的主体成分共5 种，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁分别占53.389%、31.659%和7.836%，合计92.884%。‘云台金桕’中类黄酮含量1%以上的主体成分共4 种，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁分别占52.125%、28.406%和15.623%，合计96.154%。槲皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷和芦丁为3个品种共有主体成分。‘云台红桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量较多。

表3 3 个乌桕品种叶片转色前后类黄酮含量

3 个乌桕品种叶片主体成分中，芦丁含量相差不大，但‘连桕1 号’和‘云台金桕’中芦丁含量分别是‘云台红桕’的1.46 倍和1.98 倍。‘连桕1 号’和‘云台红桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量均为是‘云台金桕’的1.12 倍和。‘连桕1 号’中槲皮苷含量分别是‘云台红桕’和‘云台金桕’的1.76 倍和1.26 倍。‘连桕1 号’和‘云台红桕’中槲皮素含量为‘云台金桕’的1.62 倍和1.42 倍。

转色后，‘连桕1 号’中含量占其类黄酮总量1%以上（含1%）的主体成分共4 种，其中槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁分别占53.214%、30.748%和11.031%，合计94.993%。‘云台红桕’中主体成分有6 种，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁分别占48.074%、31.659%和8.513%，合计88.246%。‘云台金桕’中主体成分共6 种，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁分别占45.108%、26.995%和12.029%，合计84.132%。槲皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷和芦丁为3 个品种共有主体成分。槲皮素主要存在于‘云台金桕’。山奈酚在‘连桕1 号’中含量较少。

3 个乌桕品种叶片主体成分中，‘连桕1 号’和‘云台金桕’中芦丁含量分别是‘云台红桕’的1.38 倍和1.46 倍。‘连桕1 号’和‘云台红桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量相差不大，但‘连桕1 号’和‘云台红桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量分别是‘云台金桕’的1.17 倍和1.22 倍。‘连桕1 号’槲皮苷含量为‘云台红桕’和‘云台金桕’的1.18 倍和1.21 倍。‘云台金桕’中槲皮素含量分别是‘连桕1 号’和‘云台红桕’的2.82 倍和1.89 倍。3 个乌桕品种中山奈酚含量相差不大。

2.3 3 个乌桕品种叶片类黄酮分类

由表4 可知，3 个乌桕品种叶片中类黄酮成分主要为槲皮甘类、槲皮素类、芦丁类、儿茶素类和其他类型。除其他类外，3 个乌桕品种叶片转色后槲皮甘类、槲皮素类、芦丁类和儿茶素类含量较转色前均有不同幅度的提高。3 个乌桕品种转色前与转色后含量较高的均为槲皮甘类、槲皮素类和芦丁类。其中‘连桕1 号’转色前各分类占类黄酮总量的57.120%、31.627%和10.022%，转色后各分类占类黄酮总量的53.214%、34.663%和11.031；‘云台红桕’转色前各分类占类黄酮总量的53.389%、37.332%和7.836%，转色后各分类占类黄酮总量的48.047%、48.883%和8.513%；‘云台金桕’转色前各分类占类黄酮总量的52.125%、31.142%和15.623%，转色后各分类占类黄酮总量的45.108%、39.681%和12.029%。

表4 3 个乌桕品种叶片类黄酮分类

3 结论与讨论

本研究利用超高效液相色谱和液相质谱联用技术对3 个乌桕品种叶片中类黄酮含量进行定性定量分析，共检测出13 种类黄酮成分，其中槲皮甘类1 种、槲皮素类3 种、芦丁类1 种、儿茶素类2 种、其他成分6种。根据标准曲线计算所得各成分含量0.997 以上，表明试验所建立的类黄酮成分定量分析方法能有效定量各成分含量。

有学者研究发现，乌桕叶中存在槲皮素、山奈酚、没食子酸乙酯等15 种化合物[16-17]，霍光华等[18]研究发现，乌桕叶中主要类黄酮物质为槲皮素、山奈酚及其组成的甙。本研究检测到的儿茶素、二氢杨梅素、表儿茶素、芦丁、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等13 种类黄酮成分，其中槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁为3 个乌桕品种共有的主体成分。

顾雪等[19]从乌桕叶片中检测到4 种类黄酮物质，分别为槲皮素、槲皮苷、山奈苷及异槲皮苷，从乌桕叶片乳汁中分离出山奈酚、异槲皮苷和槲皮素。银杏中主要类黄酮物质为槲皮素、山奈酚和异鼠李素[20]。芦丁是黄色系大叶榉叶片中主要成分[21]。本研究‘云台红桕’叶片转色后槲皮素含量占类黄酮总量的40.883%，高于连桕号、‘云台金桕’的34.663%、30.681%，说明槲皮素类为‘云台红桕’叶片转色后呈现红色的主要色素成分。槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷在3 个乌桕品种叶片转色后，不仅相对含量较高，而且其占类黄酮总量百分比亦较高，如‘云台红桕’叶片转色后槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量和百分比均高于‘连桕1号’和‘云台金桕’，说明槲皮素类尤其是槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷是决定‘云台红桕’转色后叶片呈现红色的主要色素成分。该结论与Mattivi 等[22]及张琼等[23]研究结果基本一致。在3 个乌桕品种中，芦丁类含量占比在‘云台金桕’叶片转色后最高，其次为‘连桕1 号’，‘云台红桕’最少，说明芦丁是‘云台金桕’叶片转色后呈现黄色的主要色素成分。在3 个乌桕品种叶片转色后，‘云台金桕’叶片中芦丁相对含量最高，且百分比最高，说明芦丁是‘云台金桕’叶片变黄的主要色素成分。该结论与Li 等[24]研究结果基本一致。

3 个乌桕品种类黄酮成分类型主要为槲皮甘类、槲皮素类、芦丁类和儿茶素类。‘连桕1 号’叶片转色后槲皮甘类高于‘云台红桕’和‘云台金桕’，‘云台红桕’叶片转色后槲皮素类高于‘连桕1 号’和‘云台金桕’，‘云台金桕’叶片转色后芦丁类高于‘连桕1 号’和‘云台红桕’。

本研究明确了乌桕叶片转色前与转色后类黄酮成分、含量及变化特征，为乌桕观赏新品种选育提供一定的科学依据。