倪子轶

（上海辰山植物园城市园艺技术研发与推广中心，上海松江 201602）

黄花白及（Bletilla ochracea）是兰科多年生草本植物，兼具观赏和药用价值。因国人过度信奉药材的野生特性，导致野生黄花白及价格虚高，人工栽培黄花白及产品相较之下价格较低，人们对其过度采挖导致野生黄花白及存量大幅度减少，直接影响了野生黄花白及的安全。如今，黄花白及野生资源不仅被国家珍稀濒危名录收录，还受到国际保护，名列国际贸易公约（CITES）附录二[1-3]。黄花白及在医药应用、护肤美妆、景观等领域的相关产业已显露出良好的发展前景，但在生产上的情况仍以低效率的传统分株繁殖为主。这种繁殖方式栽培时间长、产量低，消耗大量的植株，难以满足日益增长的市场需求。因此，提高其繁育速度，为市场提供整齐一致、无病虫害的优良植株是符合市场和技术要求的科研方向。

然而黄花白及的种子细小，在1 粒成熟的黄花白及种荚中，含有2 万～10 万粒种子。发育完好的黄花白及种子呈中间微凸、两头尖的小橄榄形，白色微泛黄；黄花白及的种子种皮中含有淀粉、脂类物质，能够辅助种子在自然状态下萌发。这一特性对黄花白及的种子萌发至关重要。种荚成熟后，种荚表皮干裂，随着种荚外壳的干裂，种子会被风吹散飘扬远方。此时，若是种子处于干燥情况，则能够保持4～6 个月的活性，发芽的条件需具备无菌环境且环境适宜。若是种子处于自然环境中，则因环境的无控性和复杂性导致即使种子萌芽，但生存困难仍然死亡。因此，由种子在自然环境中萌发而形成的群落往往极少。在萌发环境适宜的人工培育时，可观察到，胚吸水1d 即可膨大，呈绿色的球形，颜色由浅黄色变为绿色。此后，胚经过分裂的过程，通常情况下第5～6d 发芽。种子萌发出第1 片子叶继续发育10～12d，子叶由顶端分生组织的一侧分化而来。第1 片真叶从子叶相对的一面长出，这一过程要经历20d。通常利用培养基萌发种子1 个月，可以长出4～5 个小叶片。而在恶劣的野生环境下，极少有种子能萌发成苗。在人工干预下，利用组织培养技术，无菌的环境下进行播种，有利于提高萌发率，并且能缩短萌发时间[4-6]。

1 研究背景

近年来，针对黄花白及的组织培养的研究日益增多，钟宇等[7]在对快繁的方法、效率的研究中发现，当组织培养快速繁殖增殖体系完善，植物可呈几何倍数的增长。当播种和栽培行为在传统大田进行时，受到季节的限制，生产往往效率较低。与之相反的是，组织培养的操作在无菌试验室中完成，播种、栽培的环境稳定、周期短。因此，可以周年进行生产行为，一般情况下，1 年内约有6 个增殖周期。因环境、养分等繁殖条件几乎相同，产生的植株生长整齐，具有优良的商品价值。

组织培养技术具有繁殖快速、出苗整齐、产量高的特点，与分株繁殖相比，具有快捷高效的优势[8]。目前大部分黄花白及组织培养的外植体都选用种子，应用种子无菌环境下在培养基上萌发的方法，即非共生萌发方式。无菌播种繁殖技术是快繁技术的一个手段，可以解决种子过于细小、播种困难、大量繁殖的技术难点。操作通常分为5 个步骤：①按照适宜的配方配制培养基，培养基包含基本培养基和每个生长时期所需的成分；②种子消毒及接种；③愈伤组织的诱导及分化；④不定芽的增殖；⑤壮苗培养。光照强度、促分裂素等化学处理都对壮苗的培养有促进作用。何俊蓉等[9-13]研究发现，白及种胚萌发的最适培养基为1/2MS；若在培养基中加入营养物质，能够切实提高萌发率和小苗的生根效力，如10%椰汁、10%香蕉汁等。1/2MS+0.5mg/L NAA 能促进生根，MS+0.5mg/L 6-BA 能促进试管苗茎尖的增殖率。

本研究通过对黄花白及组培快繁无菌播种阶段最佳培养基的筛选、最佳增殖剂量的筛选，为黄花白及种苗规模化生产提供技术支持，有利于促进黄花白及产业的深度开发。为建立稳定而高效的黄花白及组织培养与快速繁殖体系，缩短黄花白及的成苗时间和提高质量提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 试验材料

为了使试验用的种子保持统一性，播种所用的种子来源于同一粒果荚。利用精密称量仪进行黄花白及种子称重，将每瓶种子播种量控制在0.002g 的范围。将处理过的蒴果在无菌条件下用镊子夹紧果柄一端，用解剖刀将蒴果另一端切一小口，轻轻抖动，种子就被倒出，再将种子在精密称量仪上称重，分成36 份，每份0.002g 种子。

2.2 试验方法

2.2.1 分裂素促进无菌播种增殖率的影响。基本培养基为MS+0.2mg/L NAA，分别添加0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L 6-BA、1.5mg/L 6-BA、2.0mg/L 6-BA，对照组为0mg/L 6-BA，重复9 次，观察30d 后黄花白及种子的增殖率。

2.2.2 不同培养基对促进无菌播种萌发率的影响。分裂素促进增殖试验的最佳6-BA 使用量+0.2mg/L NAA加入到对照组和试验组中。试验组培养基分别为1/2MS、1/4MS、HyponexN0.16、HyponexN0.26，对照组为基本培养基MS，重复9 次，共45 个样本。播种30d 后通过显微镜统计各组发芽数量。

2.3 试验步骤

2.3.1 试验材料及设备准备。黄花白及人工授粉时，首先要选好亲本，最好选择在开花后的1～3d 进行，此时花粉的活性较强，3d 后花粉活性逐渐降低，受孕率降低。自交授粉时先将黄花白及的花粉块取出，再放入同一株的药腔内。自交授粉1～2 周后，若柱头变粗大、花瓣下垂并内卷，则表示成功。成功结实后通常6 个月可将果实采收做无菌播种。若采下后不能及时播种，可将种子干燥保存于5℃冷藏室中，储藏时间不宜过久，最好在10d 内播种。

试验设备为蔡司A2 高成像显微和体视镜、无菌操作室台，以及培养基、0.1%升汞（HgCl2）、0.6%次氯酸钠（NaClO）、75%酒精、灭过菌的漏斗、滤纸、三角瓶、无菌水、解剖刀、长柄镊子、牛皮纸等。

2.3.2 试验材料活性测定。①TTC 试剂配制。磷酸缓冲液（pH 值7.0）：A 液称取Na2HPO4·2H2O 1.188g 溶于蒸馏水中，定容至100mL；B 液称取KH2PO40.908g 溶于蒸馏水中，定容至100mL；用时取A 液60mL，B 液40mL 混匀即可。TTC 溶液（0.5%）：称取0.05gTTC 溶于磷酸缓冲液并用磷酸缓冲液定容至10mL，置于冰箱避光冷藏备用。②染色。取少量黄花白及种子放在载玻片上，在黄花白及种子上滴1～2 滴TTC 溶液，用镊子使其混匀后盖上盖玻片，将此载玻片置于恒温箱中（35～40℃）15～20min，在显微镜（100 倍）下观察，有生命力的黄花白及种子粒呈红色，其次呈淡红色，失去活力和不育的呈无色[14-16]。

2.3.3 种荚称重及外植体消毒。将成熟未开裂蒴果用自来水、洗洁精轻微搓洗，并将种荚浸洗1h。将种子浸洗后拿出到无菌操作台上进行消毒工作。

将无菌操作台提前20min 打开风机和紫外线灭菌功能，操作人员20min 后开始操作，并关闭紫外线灯，保留操作台吹风功能。将种荚在75%酒精浸泡1min，再用高温消毒过的镊子拿出种荚，浸泡0.1%升汞溶液15min，最后依次用4 瓶无菌水浸洗4 次。将种荚取出后放置在滤纸上备用。

2.3.4 接种。将种子取出放入灭过菌的三角瓶内，加浓度0.6%的次氯酸钠（NaClO）浸泡15min，每3min 摇晃1 次，在带有滤纸的漏斗中过滤，用无菌水冲洗3 次，过滤后将带有种子的滤纸贴在培养基上，种子即附着于培养基上。每瓶播种完成后应立即密封盖上瓶盖，将播种瓶放置于培养室。组培室常规培养条件调控为：温度25±2℃，光照2000Lx，12h/d。

2.4 数据处理

采用Excel 2019 软件进行数据整理。增长率（%）=发芽量/播种量×100。

3 结果与分析

3.1 分裂素促进无菌播种增殖率的影响

由表1 和图1 可知，添加一定量的6-BA 能提高黄花白及发芽数及增长率，且呈先升后降的趋势，发芽数及增长率在添加1.5mg/L 6-BA 时达到峰值。表明黄花白及种子无菌播种增殖处理时，基本培养基MS+0.2mg/L NAA 添加1.5mg/L 6-BA 增殖效果最优。

表1 对照组与试验各组发芽平均值对照表

图1 不同浓度分裂素促发芽量与增长率对比图

3.2 不同培养基对促进无菌播种萌发的影响

使用1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 作为增殖剂，加入不同的培养基中。由表2 可知，试验组各培养基中黄花白及种子活力均比对照强，发芽量均比对照高。其中以HyponexN0.16 培养基的最发芽量好，为198.04个。

表2 对照组与试验各组发芽量平均值对照表

4 结论

李伟平等[17]利用1/2 MS 培养基作为基础培养基，以白及种子作为包埋材料，研究白及的人工种子的制备条件，研究显示，人工种子里加入的不同激素，对提高种苗后期的生长速度及质量效用极高。白及人工种子制备技术不仅为白及田间大规模种植提供可行性，同时也极大地降低生产成本。在分裂素促进无菌播种增殖率的影响试验中，黄花白及培养基MS+0.2mg/L NAA 中添加1.5mg/L 6-BA 增殖效果为峰值，添加2.0mg/L 6-BA 时，增殖量不升反降。表明增殖量并不随6-BA 的添加量无限上升。而添加1.5mg/L 6-BA 的增殖效果最优。因此，过量地添加分裂素反而不利于增殖，适度添加分裂素可以避免不必要的成本，为工厂化生产提供了有利条件。

张建霞等[18]在对白及种子萌发使用培养基的研究中发现，添加花宝（Hyponex）可促进种子萌发及幼苗生长，在不同培养基对促进无菌播种萌发率的影响试验中，使用1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 作为增殖剂，发芽数量在使用HyponexN0.16 培养基时为最高值,其次为HyponexN0.26 培养基，本试验结果与其一致。因此，在生产过程中添加HyponexN0.16 可达到较好的效果。