马俊秀，闫更轩，陈盛宇，吴皓琼，张淑梅

（黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

蔬菜是人们生活中必备的食品，其产量与品质对菜篮子工程影响较大。蔬菜生产过程中病害发生不可避免，其中，软腐病是最常见的细菌病害。该病害寄主广泛，可侵染白菜、番茄、马铃薯、甘蓝、葱类、黄瓜、萝卜、芹菜等几十种蔬菜；危害期长，一年四季在蔬菜生产和贮藏各个时期均可发生；危害大，居蔬菜细菌病害之首，造成了重大的经济损失，制约了蔬菜产业发展。

传统化学药剂的长期施用对土壤生态环境、农产品安全及人畜健康的危害日益凸显，生物防治具有绿色安全、无毒无害等优点，符合农业可持续发展要求，是蔬菜软腐病防治的重要方向和研究热点，具有非常广阔的应用前景。本研究综述了国内外蔬菜软腐病生物防治的最新研究进展，为蔬菜软腐病的生物防治新技术研发提供参考。

1 蔬菜软腐病研究概况

1.1 病原菌

蔬菜软腐病是一种遍布全球的流行性细菌病害，可引起蔬菜腐烂变质。果胶杆菌属（Pectobacte⁃riumspp.）、芽胞杆菌属（Bacillusspp.）、黄杆菌属（Flavobacteriumspp.）和假单胞菌属（Pseudomonasspp.）是主要致病菌。迄今研究发现，果胶杆菌属（以前是欧文氏杆菌属Erwiniasspp.）是最主要的软腐病原菌，也是人类首次发现的植物病原细菌［1］，主要包括胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种（E.carotovora. subsp.carotovora，Ecc）、菊欧文氏菌（E.chrysanthemi，Ech）、胡萝卜软腐欧文氏菌黑茎亚种（E.carotovora.subsp.atroseptica，Eca）［2］。3 种病原菌的分布范围以及寄主有所差别，其中Ecc寄主和分布范围更广，是国内外研究较多的病原菌。近年来，将细菌性软腐病病原菌Erwinia carotovora和Er⁃winia chrysanthemi归到果胶杆菌属（Pectobacteriumspp.）和迪基氏菌属（Dickeyaspp.），并被归入肠杆菌科［3］。果胶杆菌属主要包括4 个种，分别为P.caroto⁃vorum（Pc）、P.wasabiae（Pw）、P.betavasularum（Pb）和P.atrosepticum（Pa）。Pc在种内具有多样性，被划分 为P.carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc）［4］、P.carotovorumsubsp.odoriferum（Pco）［5］和P.carotovo⁃rumsubsp.brasiliense（Pcb）［6］3 个亚种。研究发现，Pcc可以感染部分观赏性花卉植物和数百种蔬菜，在许多地区的发病植物上均可发现，是软腐病菌中分布最广泛的病原菌［7］。

1.2 软腐病菌致病机理

植物与病原菌互作过程中，病原菌会产生生物被膜、毒素物质、细胞壁降解酶和抗生素等一系列致病因子。软腐病菌可以产生果胶酶（多聚半乳糖醛酸酶和果胶酸盐裂解酶）、纤维素酶以及蛋白酶［8］等多种细胞壁降解酶，是软腐病菌发挥致病性的主要因子。其中，果胶酸盐裂解酶在软腐病致病过程中起重要作用，通过降解植物细胞壁，使植物组织瓦解、植株腐烂，另外2 种酶配合其他酶协同侵染，最终导致植株腐烂病变［9-11］。寄主与病原菌之间的互作分为亲和与非亲性互作2 种类型，非亲和性互作中，病原菌不能大量繁殖，处于潜伏侵染状态，植物不表现明显症状；亲和性互作中，病原菌大量繁殖，表现出明显的软腐病症［12］。

1.3 软腐病发生规律及侵染途径

软腐病常常发生在低洼、连作的地区。另外，土壤缺氧、连续阴雨、地表有水、高温高湿等不利环境更容易使蔬菜感病。病菌通常存在于感病植株与病残体、土壤、粪肥、昆虫等环境中［13］，通过昆虫、自然和人为伤害传播。病菌可通过植株伤口或者自然条件下产生的裂口侵入植株中，也可以植株的幼苗或根苗为媒介侵入［14］。植株水分过多、长时间干旱或者深根损害会扩大伤口，使植株更容易发病。

2 软腐病生物防治策略

2.1 生防微生物

2.1.1 生防细菌 细菌是植物病害生物防治的研究主体，其防病机制主要包括竞争、抗生、诱导植物抗性等。1 种生防细菌可通过几种生防机制协同发挥作用［15］，防治蔬菜软腐病的生防细菌以芽孢杆菌为主。1993 年张春明等［16］从土壤中筛选到1 株对大白菜软腐病菌有强烈抑制作用的细菌，对白菜软腐病田间防效可达70%左右。2006 年贺小香［17］从409株植物内生细菌中筛选出2 株芽孢杆菌B-401 和B-208，对大白菜软腐病温室防效均可达65%。同年，鲁燕汶［18］从土样中筛到1 株具有广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌（Paenibacillu polymyxa），对白菜软腐病菌具有强烈拮抗作用。近年来，利用芽孢杆菌防治蔬菜软腐病的研究呈上升趋势。谷会等［19］从采后辣椒中筛选到对辣椒软腐病具有较强抑制作用的植物内生芽孢杆菌pp-32，平板培养7 d 后抑制率达56.7%。杨瑞先等［20］、王超等［21］分别发现解淀粉芽孢杆菌对萝卜和白菜软腐病均具有高效抑制作用。Rashid 等［22］发现接种枯草芽孢杆菌48 h 对马铃薯软腐病具有一定的抑制作用。李磊等［23］从芹菜根际土壤中获得1 株解淀粉芽孢杆菌ZF75，对芹菜软腐病防效达89.62%，且促生效果显著，具有开发应用潜力。孙旺旺等［24］从生菜根际土壤中筛选到1 株贝莱斯芽孢杆菌BPC6，对生菜软腐病具有很好的防治效果。卢美欢等［25］在特殊生境温泉中筛选到1 株土壤定殖力强、抑菌谱广的埃吉类芽孢杆菌SWLW8，对白菜软腐病菌Pcc的治疗防效较高，具有良好生防潜力。除了芽孢杆菌外，乳酸菌和粘质沙雷氏菌也可作为生防菌防治蔬菜软腐病。Tsuda 等［26］发现乳酸菌（LAB）在田间条件下可以降低大白菜细菌性软腐病的危害程度，该菌对洋葱、马铃薯和番茄的软腐病害也有抑制作用。冯迪南等［27］采用室内平板试验筛选到1 株粘质沙雷氏菌，对马铃薯细菌性软腐病菌Pcb具有良好拮抗作用。

研究发现，黏细菌（myxcobacteria）对于植物病原细菌和真菌具有很好的防治效果，是一种新型生防微生物资源菌［28，29］，未来对于黏细菌防治植物软腐病方面研究有待进一步开展。

2.1.2 生防放线菌 放线菌在土壤中广泛存在，可以产生抗生素等多种丰富的次级代谢产物，是农业生产中使用最多的微生物类群。目前，对于植病生防放线菌的报道主要集中在对链霉菌属（Strepto⁃mycespp.）和小单胞菌属（Miccromonosporaspp.）。国内在防治蔬菜软腐病方面报道较多的是链霉菌，主要依靠其产生的抗生素类活性物质发挥生防作用。李雅华等［30］从土壤中筛选到2 株放线菌菌株，对Ecc具有拮抗作用，发酵液和菌丝裂解液对Ecc抑菌圈直径分别为19.2、21.3 mm。王鹏鸣［31］报道了淡紫灰链孢海南变种和灰色链霉菌（Streptomyces griseus）2种链霉菌，其产生的中生菌素和链霉素可以抑制白菜软腐病原菌蛋白质合成，使用3%中生菌素在白菜苗期和莲座期喷施，对白菜软腐病田间防效分别可达94.7%和84.0%；若使用72%浓度农用链霉素，其田间防效在70%以上。

2.1.3 生防真菌 目前，用于植病生防的真菌主要包括木霉菌、粘帚霉、淡紫拟青霉、头状茎点霉以及毛壳菌等。木霉菌在防治蔬菜软腐病方面发挥重要作用，能够产生多种抑菌物质，通过抗生、溶菌、诱导抗性、与病原菌竞争以及重寄生等方式发挥抑菌作用。Li 等［32］发现拟康宁木霉SMF2 能够分泌1 种抗菌肽（康宁霉素），可有效防治由Pcc引起的大白菜软腐病，提高大白菜体内保护酶活性、促进植株生长。魏蜜等［33］通过平板对峙法筛选到1 株拮抗真菌草茎点霉F217-1，对白菜软腐病的平板抑菌效果显著，离体叶片防效达75%。

2.2 群体感应淬灭

群体感应（Quorum sensing，QS）是微生物中普遍存在的一种细胞间交流机制，微生物通过感知其分泌的特殊信号分子浓度来调节相关基因表达以适应环境变化［34］。群体感应系统最先在细菌中发现，它可调控抗生素产生、生物膜形成、致病基因表达等群体行为。细菌的群体感应信号分子主要包括N-酰基高丝氨酸内酯类化合物（AHLs）、烯酸类（DSF）、自诱导肽（AIPs）和呋喃硼酸二酯（AI-2）类。典型的群体感应系统包括存在于革兰氏阴性细菌中的AHL 系统、存在于革兰氏阳性细菌中AIPs 系统以及革兰氏阴阳性细菌中均有的AI-2 系统。

大量研究表明［35-37］，植物病原细菌的致病性受群体感应系统调控，阻断群体感应即群体感应淬灭作为防治植物细菌病害新策略，已成为国内外研究热点，尤其对AHL 介导系统的淬灭研究更加深入。主要的淬灭手段包括阻断信号产生、阻断信号与受体蛋白结合、降解信号分子。

蔬菜软腐病菌的群体感应系统以AHL 为主，近年来，国内外针对AHL 信号因子的淬灭研究取得了一些新进展，集中在利用能够降解AHL 信号因子的生防菌株、AHL 降解酶与AHL 抑制防治蔬菜软腐病等方面。对于AHL 降解酶，研究和应用最广泛的是AHL 内酯酶，该酶由aiiA基因编码，在芽孢杆菌、根癌农杆菌、短小芽孢杆菌、节杆菌中广泛存在，通过降解信号分子蛋白发挥生防作用，可用于防治蔬菜细菌性软腐病。Dong 等［38，39］发现分离自芽孢杆菌的内酯酶AiiA 可以有效抑制欧文氏杆菌引起的作物软腐病，提出了利用群体淬灭酶是一种防控作物软腐病的有效手段。邱健等［40］筛选到针对AHL 信号分子的AHL 内酯酶SS10，该酶通过降解Ecc产生的细胞壁降解酶降低软腐菌的危害。曾慧等［41］研究发现双效菌素（ZWA）和AHL 内酯酶具有协同增效作用，联合使用可增强对马铃薯软腐病的抗性。See-too 等［42］发现了一种新的AHL 内酯酶AidP，该酶是一种来自南极动球细菌Planococcus versutusL10.15T中的适冷性酶，可以有效防治由Pc引起的白菜软腐病。随着对淬灭酶基因的深入研究，利用表达淬灭酶工程菌株以及转淬灭酶基因植物是防控蔬菜细菌性软腐病的一种新方法。张霞等［43］将aiiA基因转入植物促生荧光假单胞菌P303 中，构建重组荧光假单胞菌P303-ss10，该工程菌在离体试验条件下可以有效抑制马铃薯和白菜软腐病菌侵入，在一定程度上抑制软腐病发生。Molina 等［44］和Qian等［45］分 别将aiiA基 因转 入生 防 细菌Pseudomonas.fluorescensP3 和lysobacter enzymogenesOHll 中，发现2 种工程菌可以显著降低由果胶杆菌引起的马铃薯和大白菜等软腐病症。Han 等［46］采用花粉管通道法将抗软腐的aiiA基因转入到大白菜中，获得对软腐病具有一定抗性的转基因白菜；Vanjildorje 等［47］利用农杆菌介导法将来自芽孢杆菌GH02 的AHL 内酯酶基因aii与马铃薯PinII 信号肽融合，构建了融合基因pinIISP-aii，也获得对软腐病具有一定抗性的转基因白菜。另外，AHL 抑制剂也是防控蔬菜软腐病、实现蔬菜保鲜的有效防治措施之一。Charron等［48］研究发现西兰花中的硫代葡萄糖苷降解产物可以抑制边缘假单胞菌（Pseudomonas marginalis）引起的西兰花细菌性软腐病，不同品种西兰花因总硫代葡萄糖苷含量不同其软腐程度有所差异，在硫代葡萄糖苷含量为22.95 μg/g 及以上的西兰花品种可有效抑制软腐病在田间的发生。Zhang 等［49］利用己醛防治白菜细菌性软腐病，己醛可以抑制白菜中胡萝卜软腐果胶杆菌和荧光假单胞菌2 种病原菌的AHL 信号分子的β-半乳糖苷酶以及胞外酶活性，从而抑制菌体生长。经己醛处理后，白菜软腐叶柄组织腐烂程度下降，且呈现浓度依赖性，在1/2 MIC 时对白菜腐烂抑制作用最强。Miguel 等［50］从盐角草（Salicornia europaea）根际分离到可以降解AHL 的菌株P6（Pseudomonas segetisstrain P6），通过HPLC 和系统发育分析显示该菌株可产生AHL 降解酶，在马铃薯和胡萝卜上接种P6 菌株后，显著降低了P.atro⁃septicum、D.solani和P.carotovorum引起的软腐症状，并且对番茄还具有一定的促生作用。Fan 等［51］分离到1 株中间苍白杆菌D-2（Ochrobactrum inter⁃mediumD-2），Zhang 等［52］分离到1 株新型不动杆菌菌株XN-10（Acinetobactersp.XN-10），2 株菌株均具有较好的AHL 降解活性，能有效降解各类AHL 信号分子，利用气相色谱-质谱联用技术分析了AHL 的降解产物组成，确定菌株D-2 是通过水解方式降解AHL，菌株XN-10 是通过水解和去羟基化2 种方式降解AHL，对D-2 全基因组分析鉴定其内酯酶为AidF。施用2 株AHL 降解菌发现均可以显著降低软腐病菌Pcc的致病性，在一定程度上抑制该病原菌在白菜、马铃薯和萝卜上产生的组织浸渍，有效减轻软腐病的发生。

大量研究表明，AHLs 信号在防控蔬菜软腐病菌毒性方面具有良好的应用前景，将是今后蔬菜软腐病生物防治研究重点，同时也应积极探索其他群体淬灭方式，以挖掘效果更佳的淬灭途径。

2.3 噬菌体疗法

噬菌体（Phage，bacteriophage）是一类专性感染细菌的病毒，作为植物细菌病害生物防治手段之一越来越受到重视。利用噬菌体防治马铃薯黑胫病、猕猴桃溃疡病、梨果火疫病、番茄青枯病、白菜软腐病等，已经取得了一些成效。几种噬菌体产品已经在美国登记注册，用于防治番茄细菌性溃疡病、斑点病等。近年，利用噬菌体防治蔬菜细菌性软腐病的研究处于快速发展阶段。Lim 等［53］为了控制由Pcc引起的白菜、马铃薯和番茄等蔬菜细菌性软腐病和茎腐病，分离筛选到一种噬菌体PP1，属于有尾噬菌目（Caudovirales）中的短尾噬菌科（Podoviridae）家族，该噬菌体对Pcc具有高度特异性，对其宿主细菌具有快速而强大的裂解活性，可以显著降低Pcc的致病性。Robert 等［54］从波兰中部马铃薯样品中成功分离到针对胡萝卜软腐果胶杆菌（Pcc）、马铃薯黑胫病菌（P.wasabiae）和植物腐败菌（Dickeya solani）的噬菌体ΦPD10.3 和ΦPD23.1，生测结果表明，单一噬菌体对马铃薯块茎软腐程度降低80%，混合噬菌体使马铃薯块茎软腐程度降低95%。Adriaenssens［55］、Evelien 等［56］针对Pectobacterium carotovorum和Dick⁃eya solani2 种蔬菜软腐病菌分离到vB_DsoM_LIME⁃stone1 和vB_ DsoM_LIMEstone2 2 个噬菌体，实验室和田间试验显示可降低马铃薯块茎的发病率和软腐程度，并提高马铃薯产量。Elhafeez 等［57］从埃及马铃薯栽培田土样中分离到2 株噬菌体vB_KsaM-C1和vB_KsaO-C2，可减轻马铃薯软腐病症状。Muturi等［58］在马铃薯叶片上接种病原菌1 h 内施用噬菌体，叶片软腐病症状减轻90%。Voronina 等［59］利用噬菌体PP16 浸泡受感染的马铃薯种子块茎，有效抑制软腐病发生，植株萌发率显著提高。

研究者对噬菌体特性及生防机理进行了深入研究［60-62］，发现了针对Pcc的新噬菌体Jarilo［63］，未来将会发现更多新型高效的噬菌体应用于防治蔬菜软腐病中。

2.4 新型微生物蛋白农药

新型微生物蛋白农药属于蛋白激发子类物质，不直接作用于靶标病原物，通过激发植物自身免疫，使植物抵抗病原菌侵染，提高植物免疫力，促进植物生长。目前，研究较多的有超敏蛋白、隐地蛋白和激活蛋白。超敏蛋白是1992 年研究人员从植物病原细菌-解淀粉欧文氏菌中发现的，是目前最具代表性的蛋白农药，对作物的多种病害具有很好的防治效果。Qiu 等［64］和陈国参等［65］发现超敏蛋白制剂可以有效控制大白菜软腐病，对大白菜软腐病的防治效果高达90%。赵烁［66］发现喷施超敏蛋白提高了马铃薯对软腐病的抗性。隐地蛋白和激活蛋白来源于植物病原真菌，对植物病毒病和真菌病防治效果显著。微生物蛋白农药是植病生物防治的重要手段之一，今后，随着对生防功能蛋白研究的深入，蛋白农药将会成为防治蔬菜软腐病的重要手段。

2.5 小RNA 基因沉默

细菌小RNA（small RNA，sRNA）是细菌中的非编码基因，作为转录后调控因子调节细菌毒力因子、生物膜形成、抗生素耐药性等相关基因表达［67］。研究发现，许多细菌sRNA 参与调控细菌致病性，Zhang 等［68］报道了梨幼果接种sRNA（rhyhA 和rprA）缺失突变的软腐欧文氏病菌后，梨幼果的腐烂程度状明显减轻。目前，已初步揭示了sRNA 在软腐病菌致病过程中的作用机制，即病原菌中的内源性非编码小RNA 以RNA 沉默机制调控与植物免疫应答相关基因的表达。Ecc是引起蔬菜软腐病常见的病原菌，Sun 等［69］发明了一种高效克隆病原调控小RNA 的方法，构建了小RNA cDNA 文库，用于研究白菜内源性小RNA 对Ecc感染的反应。王纯婷［70］研究了Hfq 蛋白和sRNA 在软腐果胶杆菌PccS1 致病过程中的功能，发现sRNA（ArcZ）缺失突变后PccS1的致病能力显著降低，筛选到ArcZ 靶标基因，为后续利用sRNA 防治软腐果胶杆菌引起的软腐病奠定基础。Dickeya dadantii是引起蔬菜软腐病的另一种病原菌，其致病性与植物细胞壁降解酶（PCWDEs）、三型分泌系统（T3SS）和鞭毛运动等多种基因协同表达调控相关。Yuan 等［71］发现了一种用于控制由Dickeya dadantii引起的蔬菜软腐病病原菌毒力的新型反馈信号通路，该信号通过连接环鸟苷二磷酸（cdi-GMP）和2 个机制不同的sRNA（ArcZ）和（RsmB）来控制该软腐细菌的毒力，具体指以RNA 伴侣Hfq通过影响全局转录后调节系统RsmA/RsmB 的活性，以及通过2 种机制不同的ArcZ 和RsmB 的c-di-GMP 信号的活性来调控毒力决定因素。该报道对Dickeya dadantii毒力控制的多层复杂调控机制的新见解可促进靶向其毒力抑制剂的发现，为防治该病原菌引起的蔬菜软腐病提供一种新思路。近年来，高通量测序技术发展迅速，在蔬菜软腐病菌中会有更多与致病性相关的小RNA 被发现，且随着小RNA在致病过程中的基因沉默机制及其调控网络的深入研究，未来小RNA 基因沉默将成为蔬菜软腐病菌的生物防控新选择。

2.6 植物源活性物质

近年，国内在利用植物源活性物质防治植物细菌病害方面开展了一些研究，但多数处于实验室阶段。周燚等［72］和刘霞等［73］发现，瓦松提取物和卷柏乙醇提取物可以明显降低大白菜软腐病害发生率。闵华等［74］在探讨中草药作为植物源农药防治植物病害的研究中发现，丁香提取物对白菜软腐病菌的抑制作用达100%。贺理等［75］研究发现，洋葱鳞叶和大蒜鳞茎的水提液对Ecc具有一定抑制作用，其中大蒜鳞茎水提液作用效果显著。中国植物资源丰富，植物源活性物质作为一种潜在的生防资源在防治细菌病害方面将发挥重要作用。

3 展望

细菌性软腐病是制约蔬菜种植业发展的主要病害，随着国家药肥双减政策的实施、生态环境与食品安全以及农业可持续发展的要求，蔬菜软腐病生物防治将发挥越来越重要的作用。本研究综述了蔬菜软腐病多种生物防治方法的研究现状，体现出蔬菜软腐病生物防治趋向多元化，每种方法各具优势，但也存在一定的局限性，很多方法尚处于实验室起步阶段，存在防效不稳定、防治作用单一和商业化生产困难等不足之处。目前，生态环境的复杂性使单一的防控技术难以达到对软腐病的长期稳定控制，因此，将生物防治与物理、化学以及农业防治措施相结合，对蔬菜细菌性软腐病的防治可以产生协同增效作用。现有的生物防治技术存在应用作物和抗菌谱窄的局限性，鉴于蔬菜病害多发混发现状，未来应着重研发对多种蔬菜、多种病害起作用的广谱、高效的防控方法。目前，随着对软腐病菌的致病机理由浅入深的认知、分子生物学等技术的日益完善以及人们对转基因等技术的科学认识，效果更佳的生物防治技术将会不断涌现，群体感应淬灭、小RNA 基因沉默等新技术将会更加成熟。