张 宁，张晶晶，李雅淑，李冉琪，侯 微，曲正义，李亚丽，郑培和,2*

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林农业科技学院，吉林 132109）

人参Panax ginseng为五加科人参属多年生草本植物，是我国历史悠久的名贵中药材。现代研究认为人参具有抗疲劳、抗氧化、抗糖尿病及抗癌等作用[1]。人参黑斑病作为人参重要病害之一，直接影响了人参的产量和品质。人参黑斑病主要由人参链格孢Alternaria panax引起，多发病于人参叶片，产生灰褐色病斑，导致植株光合作用速率下降，影响其能量积累，造成人参植株提前落叶枯萎、果实干瘪甚至使参根减产[2]，常年发病率为20%～30%，严重时可达70%[3]。目前人参病害的防治手段主要是化学防治[4,5]，但病原菌繁殖快，适应性强，容易对化学试剂产生耐药性[6]，且长期施用化学试剂会引发药材农药残留超标、环境污染和土壤微生物失衡[7]等系列问题。生物防治安全有效，是绿色可持续的病害防治手段，对人参产业发展具有重要意义。

作为生防菌的一大类别，芽胞杆菌具有抗逆性强和抑菌谱广的特点，可通过调节激素促进植物生长，被广泛应用于植物病害防治。研究表明贝莱斯芽胞杆菌可有效防治马铃薯疮痂病、花生白绢病、小麦纹枯病等多种病害[8-10]。在人参病害防治中也发现，解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliauefaciens对人参锈腐病菌抑菌率可达 80.95%，且能明显降低人参根际土壤真菌丰度指数[11]。内生芽胞杆菌Bacillus endophyticus对人参立枯病具有较好的防治效果[12]。张晓云等[13]发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis对人参黑斑病菌生长具有一定的抑制作用，抑菌率为52.58%。目前，关于人参黑斑病芽胞杆菌生防菌的研究较少，防治人参黑斑病的贝莱斯芽孢杆菌更是鲜见报道。本研究以人参链格孢为靶标菌，对人参根际土壤进行分离筛选，得到一株具有广谱抗真菌活性的生防菌株YJ 3-7，通过形态学和生物学方法对其进行了鉴定，并评估了该菌株的抑菌作用和防治效果，旨在丰富人参生防菌资源，为人参黑斑病的生物防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、人参链格孢A.panax、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、腐皮镰刀菌Fusarium solani、土赤壳Ilyonectria mors-panacis、刺盘孢Colletotrichum higginsianum、交链格孢Alternaria alternata和细极链格孢Alternaria tenuissima，由中国农业科学院特产研究所保存。贝莱斯芽胞杆菌B.velezensisYJ 3-7，分离自吉林市左家镇人参根际土壤。

供试人参种苗：4年生黄果品种人参种苗，购买自吉林省桦甸市。

供试培养基：PDA培养基用于拮抗作用试验，LB培养基用于细菌分离和保存。

1.2 拮抗菌的分离纯化与筛选

参考许帅等[14]的方法处理土壤样品，分别取100 μL浓度为10-3、10-4和10-5土壤悬浮液涂布于LB平板上，28 ℃培养24 h后，挑选单菌落平板划线纯化，镜检无杂菌后，4 ℃冰箱保存备用。

以人参链格孢为靶标菌，采用平板对峙法[15,16]筛选具有显著拮抗效果的细菌。在 PDA平板中央接种直径为5 mm的人参链格孢菌饼，在距菌饼20 mm处相对的4点，用接种针点接待测菌株，以不接分离菌株的平板为对照。25 ℃培养观察抑菌效果，待培养至对照组菌落占培养皿总面积 75%以上，十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。抑菌率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌块直径）×100。在对峙平板上挑取靶标菌落边缘菌丝，置于光学显微镜下观察人参链格孢菌丝形态。

1.3 菌株YJ 3-7的鉴定

1.3.1 形态学观察 将拮抗菌株在LB培养基上划线培养，25 ℃培养72 h，观察记录菌落形态、颜色和透明程度，对拮抗菌株进行革兰氏染色试验并置于显微镜下观察。

1.3.2 分子生物学鉴定 使用细菌基因组提取试剂盒提取菌株YJ 3-7的基因组DNA，利用细菌通用引物27-F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492-R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）以及 gyrA-F（5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'）和 gyrA-R（5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3'）PCR扩增YJ 3-7的16S rDNA和gyrA基因序列。PCR反应条件：94 ℃预变形4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对，获得同源序列，使用Mega 7.0软件以邻接法构建系统发育树。

1.4 菌株YJ 3-7不同发酵液对人参链格孢生长的抑制作用

挑取菌株YJ 3-7接入LB液体培养基中，25 ℃、180 r/min振荡培养72 h制备菌株YJ 3-7发酵液，菌体数量为1×108cfu/mL。将发酵液室温10000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm孔径滤膜过滤除菌，滤液为无菌发酵液；将发酵液室温10000 r/min离心10 min，收集菌体使用无菌水将菌体重悬，调整菌悬液浓度为5×107cfu/mL；将发酵液放置于高压灭菌锅，121 ℃、15 min即为灭活发酵液。分别将发酵液、无菌发酵液、菌悬液和灭活发酵液以10%的比例添加到PDA培养基中并倒平板，以不添加其他液体的PDA培养基作为对照，每个处理3次重复。待平板凝固后在中央接入直径5 mm的人参链格孢菌饼，25 ℃恒温培养至对照组菌落占培养皿总面积的75%以上，十字交叉法进行测量计算抑菌率。

1.5 菌株YJ 3-7对人参黑斑病的防效测定

1.5.1 离体叶片试验防效测定 将人参链格孢转接到PDA培养基上，25 ℃静置培养15 d备用。在培养皿中铺一层湿滤纸，放入无菌载玻片，并放置一个湿棉球备用。取人参展叶期新鲜叶片，用75%酒精表面消杀30 s，无菌水冲洗2～3次，超净工作台中晾干。使用无菌牙签对叶片进行创伤处理，每个叶片刺伤 2处，向叶片喷洒菌株YJ 3-7发酵液，待叶片表面风干后将叶片放置在培养皿中的载玻片上，向刺伤处接种人参链格孢4 mm菌饼，封口膜封口。试验设喷洒无菌水作为对照，每个处理6个重复。于光照培养箱中25 ℃、12 h光暗交替培养6 d，采用十字交叉法记病斑直径，计算抑菌率。

1.5.2 盆栽试验防效测定 将人参种苗栽种在直径21 cm、高15 cm的盆钵中，基质配比为草炭土:珍珠岩:蛭石＝5:4:1，每盆3株，温室培养人参生长至展叶期，选取长势基本一致的健康人参苗进行试验。使用无菌牙签避开叶脉在人参叶片上制造伤口，每个叶片6处，向人参植株均匀喷施菌体数量为1×108cuf/mL的菌株YJ 3-7发酵液，至每片处理叶片均滴下液滴。以喷施多菌灵1000倍液作为对照，喷施无菌水作为空白对照，24 h后向叶片伤口处接种10 μL黑斑菌菌丝段悬液（1×106cfu/mL），每组每次处理9株人参植株（约100片叶片），3次重复，接种病原菌后温室培养10 d统计病害情况。病害分级标准及计算参考刘亚苓等[17]。

1.6 菌株YJ 3-7抑菌谱测定

参照1.2中平板对峙法测定菌株YJ 3-7对其他8种病原菌的抑制作用。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选

从人参根际筛选共分离出细菌 73株，其中菌株YJ 3-7对人参链格孢的抑制作用最强（图1），抑制率达 83.77%。使用显微镜观察对峙平板菌丝和对照菌落菌丝，发现与正常生长的人参链格孢菌丝相比，YJ 3-7对峙培养的人参链格孢菌丝细弱，隔膜间的菌丝膨大，整个菌丝呈不规则弯曲凸起现象（图2）。

图1 菌株YJ 3-7对人参链格孢的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of YJ 3-7 strain on A.panax

图2 显微镜下菌株YJ 3-7对人参链格孢的抑制作用Fig.2 Microscopically inhibiting effect of strain YJ 3-7 on A.panax

2.2 拮抗菌的鉴定

菌株YJ 3-7在LB培养基上生长状态良好，菌落呈不透明乳白色，培养 24 h后菌体呈光滑圆斑状，边缘规则，表面湿润；培养48 h后菌体表面出现粗糙皱褶，边缘呈不规则波浪形，挑取时呈黏稠状（图 3A）。显微镜观察菌株呈单细胞杆状，革兰氏染色呈阳性（图3B）。

图3 菌株YJ 3-7在LB培养基上的菌落形态（A）和菌体显微镜形态（B）Fig.3 Colony morphology of strain YJ 3-7 on LB medium (A)and microscopic morphology (B)

测序获得菌株YJ 3-7的16S rDNA基因序列1105 bp，gyrA基因序列930 bp。将两组测序结果在NCBI上进行BLAST序列分析发现，菌株YJ 3-7的 16S rDNA序列与贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensisKKLW（CP054714.1）相似性为98.45%（图4）；gyrA序列与贝莱斯芽胞杆菌At1（CP041145.1）和 NGN-6（NZ_CP007165.1）相似性均为 99.79%（图5）。使用MEGA7软件中的邻接法构建系统发育树，二者均与贝莱斯芽胞杆菌聚为一类。综合菌落形态、革兰氏染色、16S rDNA和gyrA基因系统发育分析，将菌株YJ 3-7鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。

图4 基于16S rDNA基因序列构建菌株YJ 3-7系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain YJ 3-7 based on the sequence of 16S rDNA

图5 基于gyrA基因序列构建菌株YJ 3-7系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain YJ 3-7 based on the sequence of gyrA gene

2.3 菌株YJ 3-7不同发酵液对人参链格孢生长的抑制作用

使用添加不同处理的菌株YJ 3-7发酵液制作的培养基进行抑制试验，添加菌株YJ 3-7发酵液和菌悬液的培养基上人参链格孢几乎不生长，抑菌率分别为98.76%和98.27%；添加无菌发酵液对人参链格孢具有较强的抑菌效果，抑菌率达70.62%；添加灭活发酵液对人参链格孢生长抑制能力较弱，抑制率为26.17%（表1）。

表1 菌株YJ 3-7不同发酵液处理对黑斑病菌的抑制作用Table 1 Inhibition effect of different fermentation broth of strain YJ 3-7 on A.panax

2.4 离体叶片试验

在接种人参链格孢菌饼3 d后，经菌株YJ 3-7发酵液处理的人参叶片未出现明显病斑，对照组叶片出现黄褐色病斑；接种6 d后，经菌株YJ 3-7发酵液处理的人参叶片病斑较小，病斑直径为4.13 mm，对照组叶片病斑较大，病斑直径约11.21 mm。接种6 d后，菌株YJ 3-7发酵液对人参链格孢的抑制率为63.24%，表明菌株YJ 3-7对人参链格孢侵染离体叶片具有良好的防治效果（图6）。

图6 菌株YJ 3-7发酵液在人参离体叶片上对人参链格孢的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of fermentation broth of strain YJ 3-7 on A.panax on detached leaves of ginseng

2.5 盆栽试验防效

如表2和图7所示，菌株YJ 3-7处理组的病情指数为22.81，略高于多菌灵稀释液处理组，显著低于对照组的病情指数71.11。菌株YJ 3-7和多菌灵1000倍液对人参黑斑病的防效达67.92%和72.81%，表明菌株YJ 3-7对人参黑斑病具有较好的防治效果。

表2 菌株YJ 3-7发酵液对人参黑斑病的防治效果Table 2 Control efficiency of strain YJ 3-7 fermentation broth on ginseng black spot disease

图7 菌株YJ 3-7发酵液对人参黑斑病的防治效果Fig.7 Control efficiency of strain YJ 3-7 fermentation broth on ginseng black spot disease

2.6 抑菌谱测定

平板对峙试验结果表明，菌株YJ 3-7对其他8种病原菌均表现出良好的抑制效果（图8），抑菌率均在 65%以上，其中对刺盘孢的抑制作用最强，抑菌率可达 82.29%，对灰葡萄孢的抑制作用最弱，抑制率为65.73%（表3）。

图8 菌株YJ 3-7对病原真菌的拮抗作用Fig.8 Antagonism assay of strain YJ 3-7 against fungal phytopathogens

表3 菌株YJ 3-7对病原真菌的拮抗作用Table 3 Antagonism assay of strain YJ 3-7 against fungal phytopathogens

3 讨论

近年来，由于化学农药的不合理使用，农业生态环境遭到严重破坏，土壤状况也不容乐观。随着全球对可持续发展的日益重视，生物防治替代化学防控已迫在眉睫[19]。贝莱斯芽胞杆菌与解淀粉芽胞杆菌亲缘关系密切，可以促进植物生长发育，改善土壤环境[20,21]，产生细菌素、抗菌肽物质限制植物病原菌生长[22,23]。多项研究表示贝莱斯芽胞杆菌可影响病原真菌正常生长代谢，使真菌菌丝出现明显细弱、扭曲和肿胀现象[24,25]。目前，已有贝莱斯芽胞杆菌在香蕉枯萎病、扁豆枯萎病、葡萄灰霉病和小麦赤霉病等病害防治相关的研究[26-29]，但贝莱斯芽胞杆菌在人参病害防治方面鲜有报道。本研究从人参根际分离出了一株对人参链格孢生长具有抑制作用的菌株YJ 3-7，经形态学观察、16S rDNA和gyrA基因系统发育分析将其鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。菌株YJ 3-7可有效限制人参链格孢的生长，使人参链格孢菌丝出现明显扭曲和肿胀现象，抑制率达83.77%，其发酵液对人参黑斑病菌的也具有明显的抑制效果，该研究结果为人参黑斑病的生物防治提供了新的菌种资源。

室内平板试验仅能在一定程度上反应拮抗菌的抑菌效果，其防治能力有待进一步回归植物，通过向植物接种拮抗菌进行研究。Medhioub等[30]通过离体组织试验表示贝莱斯芽胞杆菌 OEE1可以降低梨和苹果火疫病的发病率；朱娜等[31]使用离体叶片接种实验测定出解淀粉芽胞杆菌 TS-1203对苹果叶枯病防效达70.1%；孙旺旺等[32]通过盆栽试验和大田试验对拮抗菌防效进行测定，表示贝莱斯芽胞杆菌BPC6对生菜软腐病具有较好的防治作用。本研究运用离体叶片试验及盆栽试验测定菌株YJ 3-7对人参黑斑病的防治效果，结果表明菌株YJ 3-7发酵液处理后的人参叶片病斑小、发病程度轻、发病率低，盆栽防效达67.92%，略低于多菌灵防效72.81%，说明贝莱斯芽胞杆菌可以有效限制人参叶片上黑斑病菌的生长并对叶片上病斑的扩展具有一定的抑制作用。

本研究以人参链格孢为靶标菌从人参根际分离出一株细菌YJ 3-7，可有效抑制人参链格孢生长，通过细菌形态学、系统发育分析等将菌株YJ 3-7鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。YJ 3-7发酵液、无菌发酵液和菌悬液对人参链格孢均具有良好的抑制作用，能有效防治人参黑斑病。且该菌株抑菌谱广，可抑制其他8种植物病原真菌生长，是一株有应用潜力的生防菌株。接下来将进一步探索菌株YJ 3-7的抑菌机制，通过大田试验检测拮抗菌实际抑菌效果和抑菌稳定性，为生防菌的开发和利用奠定基础。