段云鹏，姚 雪，李 品，王萌涵，胡守印，胡恩静，刘永刚，杨淑芳，魏纪珍

（河南农业大学植物保护学院/河南省害虫绿色防控国际联合实验室，郑州 450002）

转基因作物表达苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）杀虫基因是迄今为止生物技术对农业害虫防治的最重要贡献。Bt作物已在29个国家广泛种植，全球面积超过1亿公顷，占全球转基因作物种植面积的53%[1]。尽管转Bt作物在全球得到了广泛的种植，但是有关Bt杀虫蛋白的作用机制和昆虫对Bt杀虫蛋白的抗性机制还没有被完全解析。更为严重的是，抗性问题日益突出，近年来报道的昆虫抗性和田间防治失败的案例也在持续增加[2-4]。Cry1Ac作为最重要的Bt杀虫基因之一，最先在作物中表达，用于防治棉铃虫等鳞翅目害虫。目前，第一代转Cry1Ac基因棉花已在我国种植了26年，尽管有“天然庇护所”的保护，田间棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性也在显著增加[5-7]。因此，需要对Bt杀虫蛋白的作用机制和抗性机理进行更加深入的研究。

前期对Bt杀虫蛋白，尤其Cry1类蛋白受体和昆虫对Cry1类蛋白的抗性机制研究表明，其主要功能受体包括钙黏蛋白（cadherin）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）、氨肽酶（aminopeptidases-N）、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白C2（ATP binding cassette subfamily C member 2，ABCC2）和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 C3（ABCC3）等[8-12]。近些年来的研究通过双向电泳等方法也表明 V-ATPase亚基蛋白可以与Bt蛋白结合[13-15]，而且V-ATPase参与Bt的作用过程[16]，甚至改变V-ATPase的表达能够引起昆虫对Bt的耐性[17]。这说明V-ATPase亚基蛋白可能作为Bt的作用靶标正在逐步的被我们认识。

V-ATPase是一种在真核生物中进化古老的，高度保守的酶，存在于许多细胞器的膜中，如核内体、溶酶体和分泌囊泡，它们在这些细胞器的功能中发挥着各种重要作用[18]。它可以使细胞内的很多细胞器酸化，偶联ATP水解的能量，通过细胞内和真核细胞的质膜质子运输。这类酶的研究目前在其结构、功能、规律以及体外机制的阐述方面取得了巨大的进步，很多贡献归因于在昆虫中的研究[19]。在昆虫中V-ATPase是一种多亚基组成的膜结合复合酶体[15]，是昆虫中肠上皮细胞 H+离子转运体[16]。大量的证据表明昆虫的V-ATPase在Cry蛋白毒性中发挥作用[13,15,20-23]。鉴于其分布和功能的多样化，以及与Bt的作用关系，迫切地需要发现和验证V-ATPase亚基蛋白在Bt的作用机制和抗性机制中的作用。

我们在前期的研究中通过构建棉铃虫的中肠酵母文库筛选 Cry1Ac的结合蛋白中发现，棉铃虫 VATPase B可以与Cry1Ac结合，这与邹朗云等[24]报道的V-ATPase B可以与Cry1Ac结合的结果一致。VATPase B作为Cry1Ac的结合蛋白是否参与Cry1Ac的毒力过程还没有得到证实。本研究首先采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在抗感Cry1Ac棉铃虫幼虫及其受到Cry1Ac诱导时的表达情况；通过配体杂交 Ligand blot进一步地证实了其与 Cry1Ac的结合特性；通过在昆虫细胞中过表达该基因验证了其对Cry1Ac毒理的影响。本研究证实了V-ATPase B是Cry1Ac的功能受体，这为进一步研究V-ATPase B的Bt作用方式和在抗性机制中的作用，以及昆虫对Bt的抗性治理等提供重要线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 敏感品系（JY）棉铃虫购于河南省济源白云实业公司，抗性品系（LF60）棉铃虫由中国农业科学院植物保护研究所馈赠，该品系对Cry1Ac的抗性高于1000倍[25]，两种品系棉铃虫均在培养箱中使用人工饲料饲养，饲养条件为温度（26±1）℃、相对湿度（60±10）%、光周期16L∶8D。

1.1.2 细胞系及细胞培养基 草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵母细胞系（Sf9）为美国亚利桑那大学馈赠，培养在（28±1）℃的培养箱中[26]。Sf-900TMⅡ SFM培养基，含10%热激失活牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.1.3 试剂与仪器 Cry1Ac原毒素与活化毒素均购于北京绽诺思特生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒HiScript®RT SuperMix for qPCRⅢ（+gDNA wiper）、DNA聚合酶（2×Taq Master Mix）、PCR产物回收试剂盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、荧光定量PCR反应试剂盒（ChamQTM Universal SYBR®qPCR Master Mix）、质粒DNA小量提取试剂盒，购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞DH5α，购于北京擎科生物有限公司；大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；氨苄青霉素、台盼蓝染色液、20×PBS缓冲液、高效RIPA裂解液（含一支PMSF）、PAGE胶蛋白微量回收试剂盒、牛血清白蛋白V（BSA）、5×蛋白上样缓冲液，购于北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、BagⅡ酶，购于宝日医生物技术（北京）有限公司；超敏型ECL发光液，购于亚科因（武汉）生物技术有限公司；蛋白电泳凝胶制备试剂盒，购于陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司；转染试剂，购于普洛麦格（北京）生物技术有限公司；鼠抗His-Tag单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG抗体，购于亚科因（武汉）生物技术有限公司；His标签的pIEx-RFP载体由山东大学馈赠；增强绿色荧光蛋白EGFP，其序列参考[27]方法设计合成并由本实验室保存；其他化学试剂均为国产分析纯。NANODROP 1000全波长微量扫描分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产；Tanon 4600化学发光成像分析系统，上海天能科技有限公司生产；DYY-3C电泳仪，北京六一仪器厂生产；SHP-250生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司生产；Mastercycle Pro S型PCR仪，Centrifuge5417R型台式离心机，德国Eppendorf公司生产；ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司生产。

1.2 样品制备和cDNA合成

分别选取龄期及大小一致的敏感与抗性棉铃虫，收集3～5龄幼虫各5～10头，比较其不同发育时期不同品系中肠V-ATPase B的表达量。选取大小一致的4龄末期棉铃虫，独立置于24孔养虫盒中饥饿处理12 h后，饲喂含50 mmol/L Na2CO3缓冲液的人工饲料[27]作为对照组，同时饲喂含25 μg/mL Cry1Ac原毒素（LC30）[26]的人工饲料，在样品取食3、6、12、24和36 h时，每个重复取4～5头样品，解剖取其中肠，共3个生物学重复，Cry1Ac诱导后，比较不同时间点V-ATPase B基因的表达量。

利用RNA提取试剂盒在冰上分别提取各处理样品总RNA，使用DEPC水调整浓度并使用反转录试剂盒合成cDNA模板用于后续试验。

1.3 载体构建

以棉铃虫cDNA为模板，利用特异性引物V-ATPase B-CDS-F/R（表1）对V-ATPase B基因编码区（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）（登录号：XM_021331943.1）扩增，本试验中所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。50 μL PCR反应体系和扩增条件参考[27]。用1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μL PCR产物，纯化产物并将片段连接至克隆载体。用热激法将5 μL重组产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素的抗性筛选，获得阳性重组子并进行菌落PCR验证。PCR扩增条件参考[27]。经1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μL产物后，将阳性克隆菌液注入5 mL含氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养14 h，提取质粒并由北京擎科生物科技有限公司测序。

以克隆载体为模板，利用两对特异性引物 V-ATPase B-SacⅠ和 V-ATPase B-BagⅡ；V-ATPase BEcoRⅠ和V-ATPase B-XhoⅠ对V-ATPase B基因编码区扩增，50 μL PCR反应体系与扩增条件参考文献[27]。用5×Loading Buffer和1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μL PCR产物，纯化产物并将片段分别连接至表达载体pIEx-RFP与pGEX-6P-1。用热激法将5 μL重组产物转入50 μL DH5α大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素的抗性筛选，获得阳性重组子并进行菌落PCR验证。PCR扩增条件同上。经1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μL产物后，将阳性克隆菌液注入5 mL含氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养16 h，提取质粒并由北京擎科生物科技有限公司测序。

1.4 荧光定量RT-PCR反应

用特异性引物q-V-ATPase B-F/R对不同品系、不同龄期、不同处理后组织的V-ATP-B基因表达量检测，以EF-1α（U20129.1）和β-actin（HM629442.1）为内参基因设计内参引物 EF-1α-F/R和β-Actin-F/R（表1）。20 μL PCR反应体系与程序参考文献[27]。每组处理有3组生物学重复，每组生物学重复设置3组技术重复。用扩增效率和循环数的平均数计算所有基因的表达水平，采用2―△△Ct方法分析试验结果[28]。

表1 本研究所用引物信息Table 1 List of primers in this study

1.5 细胞转染和毒理测定

Sf9细胞系使用Sf-900TMⅡ SFM培养基进行培养。转染细胞并在转入24 h后观察转入pIEx-RFP和V-ATPase B-pIEx-RFP细胞并拍照[27]。转染48 h后收集细胞并用细胞计数板计数，使用96孔细胞培养板每孔接种100 μL（含1×104个细胞），置于（28±1）℃培养箱中贴壁生长2 h；在倒置显微镜200倍视野下，每孔选择两个独立视野，记录Cry1Ac活化毒素处理前的细胞存活数量。去除含抗生素和血清的培养基，加入100 μL含有200 μg/mL Cry1Ac活化毒素且无血清及抗生素的细胞培养基，置于（28±1）℃培养箱中处理5 h；记录存活细胞数[27]，收集剩余细胞用于后续试验。每次毒理测定重复3次，每组独立重复转染3次。死亡率的计算采用Abbott公式，死亡率＝（处理前细胞数目―处理后细胞数目）/处理前细胞数目×100%[29]。

1.6 V-ATPase B蛋白的提取与Western-blot鉴定

将转染后的细胞收集并500 g/min离心3 min，用1 mL 1×PBS缓冲液清洗沉淀两次，再次离心保留沉淀，加入高效RIPA裂解液100 μL、终浓度为1 mmol/L PMSF、5×蛋白上样缓冲液25 μL并混匀，沸煮5 min，-20 ℃保存备用。

根据蛋白电泳凝胶制备试剂盒说明书配置SDS-PAGE胶，并通过凝胶电泳检测目的蛋白的表达。将目的蛋白转到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜；加入1∶2000稀释的His标签小鼠单克隆抗体（一抗），室温孵育1 h；1×PBST缓冲液洗脱5次，加入1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（二抗），室温孵育1 h；1×PBST缓冲液洗脱5次，使用化学发光成像分析系统仪器拍照。

1.7 V-ATPase B蛋白的诱导、纯化与Ligand-blot验证结合

将V-ATPase B-pGEX-6P-1质粒转化表达菌株Rosetta（DE3）。通过氨苄青霉素筛选后，挑取单菌落，用含氨苄青霉素的LB培养基扩大培养，当菌液OD600约为0.6时，取1 mL菌液加入终浓度30%的甘油保存，取400 μL诱导前菌液于4 ℃冰箱保存，剩余菌液加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃，180 r/min诱导4 h。取400 μL诱导后菌液，与诱前菌液6000 r/min离心3 min，弃上清用100 μL 1×PBS重悬，加入25 μL蛋白上样缓冲液，沸煮5 min后于冰上备用。

根据蛋白电泳凝胶制备试剂盒说明书配置 SDS-Page胶，并通过凝胶电泳检测目的蛋白的表达。蛋白胶脱色后，使用胶回收试剂盒，回收纯化蛋白，置于-20 ℃备用。

用纯化后的蛋白加入终体积0.25倍的蛋白上样缓冲液，沸煮5 min，同上配置SDS-Page胶，并通过凝胶电泳展现目的蛋白。将目的蛋白转到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜；加入终浓度2 μg/mL Cry1Ac活化毒素，孵育2 h，1×PBST缓冲液洗脱5次，加入1∶10000稀释的Cry1A抗体（一抗），室温孵育1 h；1×PBST缓冲液洗脱5次，加入1∶10000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体（二抗），室温孵育1 h；1×PBST缓冲液洗脱5次，使用化学发光成像分析系统仪器拍照。

1.8 数据统计与分析

数据使用Excel 2019软件进行统计分析，不同处理间的比较采用单因素方差分析，采用t检验法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 V-ATPase B基因在Cry1Ac抗感棉铃虫品系中的表达差异

荧光定量PCR检测结果表明，V-ATPase B基因在3、4、5龄棉铃虫各龄期中肠均有表达，并且其在敏感品系JY的表达量均显著高于同龄期抗性品系LF60中的表达量（3龄中P＝0.00001，4龄中P＝0.02045，5龄中P＝0.00531，图1）。

图1 V-ATPase B基因在抗感Cry1Ac棉铃虫中表达差异Fig.1 The expression level of V-ATPase B in Cry1Ac-susceptible and -resistance Helicoverpa amigera

2.2 V-ATPase B基因响应Cry1Ac刺激下调表达

棉铃虫5龄幼虫取食含有亚致死剂量25 μg/mL的Cry1Ac原毒素后，中肠组织中V-ATPase B基因表达量显著降低。从取食3 h后一直到36 h，棉铃虫中肠中V-ATPase B表达量持续显著下降（3 h时P＝0.00480，6 h时P＝0.00002，12 h时P＝0.00013，24 h时P＝0.00003，36 h时P＝0.00001，图2）。

图2 5龄棉铃虫幼虫取食Cry1Ac后的V-ATPase B基因表达量Fig.2 The expression level of V-ATPase B of the 5th-instar Helicoverpa amigera larvae fed with Cry1Ac

2.3 Ligand blot验证V-ATPase B与Cry1Ac结合

通过原核表达V-ATPase B蛋白，经SDS-PAGE梯度胶电泳检测，V-ATPase B蛋白在80.8 kDa处表达（基因54.9 kDa＋标签蛋白25.9 kDa），结果表明V-ATPase B被成功诱导表达（图3A）。进一步地对原核表达的V-ATPase B蛋白进行纯化，基本得到一条明显单一的V-ATPase B蛋白（图3B）。然后通过Ligand blot试验证实显示V-ATPase B可以与Cry1Ac活化毒素特异结合（图3C）。说明V-ATPase B可能为Cry1Ac活化毒素受体结合蛋白。

图3 V-ATPase B蛋白的表达纯化及与Cry1Ac的结合特性Fig.3 Expression and purification of V-ATPase B protein and its binding properties with Cry1Ac

2.4 V-ATPase B的亚细胞定位

将V-ATPase B-pIEx-RFP和pIEx-RFP质粒分别转染Sf9细胞。荧光显微镜下观察到红色荧光，说明相应蛋白已成功表达于细胞中，V-ATPase B蛋白主要定位在细胞质中，在细胞核中没有表达（图4）。

图4 V-ATPase B在细胞内的表达和定位Fig.4 The expressions and localization of V-ATPase B in cells

2.5 表达V-ATPase B蛋白增强了Cry1Ac的细胞毒力

在观察到V-ATPase B蛋白的表达后，进一步通过Western blot确定了V-ATPase B蛋白在细胞内的表达（图5A）。随后，用终浓度为 200 μg/mL Cry1Ac活化毒素处理细胞，Sf9细胞的死亡率显著提高（P＝0.03233，图5B）。结果表明，过表达V-ATPase B可以增加细胞对Cry1Ac的敏感性。

图5 表达V-ATPase B对Sf9细胞毒性的影响Fig.5 Effects of overexpression of V-ATPase B on the cytotoxicity in Sf9 cells

3 讨论

本研究中我们发现V-ATPase B基因在Cry1Ac抗性品系中低表达（图1），尽管本研究中是用LF60的抗性品系跟济源购买的敏感品系（据了解近些年采于田间）相比的，但是V-ATPase B基因在室内筛选的BtR抗性品系中也显著降低表达[24]，这进一步说明了V-ATPase B基因在抗性品系中低表达是普遍存在的。此外在受到Cry1Ac诱导时，V-ATPase B基因也下调表达，这跟很多V-ATPase B基因在受到Bt诱导时低表达的结果一致[30-32]。因此V-ATPase B基因可能作为功能受体参与棉铃虫对Cry1Ac的抗性，机体通过降低V-ATPase B基因的表达来减少Cry1Ac对昆虫的伤害。

V-ATPase B作为Bt的结合蛋白已经被广泛报道，例如Qiu等[16]报道甜菜夜蛾Spodoptera exigua的V-ATPase B可以与Cry2Aa结合；Xie等[33]报道小菜蛾Plutella xylostella的V-ATPase B和Cry1Ac具有结合特性。邹朗云等[24]也通过Ligand blot证实棉铃虫的V-ATPase B可以与Cry1Ac、Cry2Ab和Cry1C结合。我们通过构建棉铃虫的中肠酵母文库筛选Cry1Ac的结合蛋白，也筛选到了结合蛋白V-ATPase B（未发表数据），在本研究中也进一步地通过Ligand blot证实棉铃虫V-ATPase B可以与Cry1Ac结合（图3）。上述研究多方证实了V-ATPase B是Cry1Ac的结合蛋白。然而，我们对V-ATPase B的亚细胞定位研究表明其主要分布在细胞质中（图4），这与其他研究报道V-ATPase B基因主要存在于细胞内许多细胞器的膜中的结果一致[18]。但是已报道的Bt蛋白的受体多位于细胞膜上，我们分析尽管V-ATPase B在胞内分布却能与Bt蛋白结合的原因，可能与之前我们推测的ATPs-α与Cry2Ab蛋白互作的方式一样[27]。一方面据报道Cry1Ac的部分结构可以插入膜内[35]，这些结构可能与膜内的受体，如V-ATPase B结合。此外，整个活化的Cry蛋白可以透过细胞膜进入细胞质[36,37]，进而与细胞质内分布的V-ATPase B结合。总之，综合文献和我们的研究结果表明棉铃虫V-ATPase B是Cry1Ac的一个结合蛋白。

V-ATPase B蛋白不但是Bt杀虫蛋白的结合蛋白，它也参与Bt的毒力过程。Qiu等[16]报道了甜菜夜蛾的V-ATPase B不仅与Cry2Aa结合，而且通过RNAi干扰V-ATPase B能显著降低甜菜夜蛾对Cry2Aa的敏感度。此外，敲除二化螟Chilo suppressalis幼虫的V-ATPase A基因导致二化螟幼虫对表达Cry2Aa和Cry1Ca水稻的敏感性显著降低[38]。本研究中，我们通过在昆虫细胞系中过表达棉铃虫V-ATPase B基因，发现细胞对Cry1Ac的敏感度增强（图5），这一结果证实棉铃虫V-ATPase B参与了Cry1Ac的毒力过程。这是我们首次报道V-ATPase B在Cry1Ac毒力过程的功能。由于V-ATPase B基因在抗性品系中低表达，同时V-ATPase B蛋白与Cry1Ac结合，我们推测棉铃虫V-ATPase B是Cry1Ac的功能受体。但是关于V-ATPase B在棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制中的作用和贡献还有待进一步的研究。