宋志雨，李陶威，张耀勇

漯河市中心医院肿瘤科，河南 漯河 462000

肺癌在中国恶性肿瘤死亡原因中居首位，其发病率及病死率均高于其他恶性肿瘤[1]。目前肺癌的病理机制还未研究透彻。报道指出，肺癌的形成与细胞内关键基因突变有关，与癌基因异常活跃和抑癌基因活性降低或不表达有关[2]。根据肿瘤的病理表现及异质性可将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。在该分类中，NSCLC占比更高。近年来，NSCLC的治疗效果显著提高，但与医师治疗期望仍有较大差距。分析原因发现，首先早期诊断证据缺乏NSCLC的特异性DNA片段，若知晓分子标记的特点，就可提高早期诊断率，延长患者生存时间；其次放化疗对无法手术的晚期NSCLC患者效果不理想，近些年来针对特定基因突变的靶向治疗为肿瘤治疗指出了新的方向。但目前仅有少数专门针对这些突变的靶向药，受益患者不多；最后制订不恰当的治疗方法亦会影响患者的生活质量和健康情况。研究指出，根据与化疗相关的基因突变制订治疗方法是可行的[3-4]。然而基于现有的基因突变，还存在检测误差大等问题。1994年，有学者将互补DNA（complementary DNA，cDNA）编码的蛋白质统一列入HUGE蛋白质数据库中，其中编码这些蛋白质的基因统一被称为KIAA基因，并在其后面给予4个数字加以区分。细胞迁移诱导透明质酸酶1（cell migration inducing hyaluronidase 1，CEMIP，也称 KIAA1199）最初被发现在内耳中高表达，近年来的研究表明，KIAA1199与NSCLC的发展密切相关，探讨KIAA1199在NSCLC患者中的表达有助于准确寻找特异性DNA片段，对评估患者病情和预后、提高治疗效果具有重要意义。本研究探讨NSCLC组织中KIAA1199的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年8月至2017年8月漯河市中心医院收治的NSCLC患者的病历资料。纳入标准：①首次确诊为NSCLC；②入院前未接受过放化疗、靶向治疗或手术治疗；③术前检查排除其他肿瘤。排除标准：①合并远处转移；②除肺脏外其他脏器衰竭；③转移性肺癌；④具有家族遗传病史。依据纳入和排除标准，本研究共纳入124例患者，其中男 67例，女 57例；平均（58.31±5.28）岁。收集NSCLC组织124例和癌旁组织（距离病灶2 cm以上）124例，标本均由手术取材获得。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学染色法检测KIAA1199表达情况

采用免疫组织化学染色法检测NSCLC组织和癌旁组织中KIAA1199的表达情况，具体步骤如下：①烤片。检查电烤箱是否完好，预定温度为60℃，预热完成后烘烤30 min，切片数量少、形状小则需适当缩减时间。②脱蜡、水化。将烘烤后的切片置于二甲苯溶液中，浸泡5 min后取出，静置5 min脱蜡。然后置于100%、95%、75%的乙醇溶液中，分别浸泡5 min，完成水化。水化后将切片用流动水冲洗，将乙醇洗去，但注意不能用力冲洗。③高压抗原修复。将500 g柠檬酸钠溶解于2 L蒸馏水中，溶解充分后置于高压蒸汽锅，完全浸泡于水中，煮沸。蒸汽锅出汽后等待2 min，然后关闭电源，待切片自然冷却后取出。分两次浸泡于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，每次5 min。④干燥切片。用免疫组化笔在组织旁画圈，为预加试剂固定于切片做准备。然后滴加3%过氧化氢，静置10 min，再用PBS溶液清洗3次，甩干。⑤一抗孵育。1∶100稀释一抗，于4℃冰箱中过夜。⑥二抗孵育。分3次浸泡于PBS中，每次3 min。滴加二抗，室温下静置30 min，PBS浸泡3次，每次3 min。⑦二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。现用现配DAB试剂并滴加，等待1 min后用PBS清洗3次。⑧苏木素染色，染色30 s后用自来水冲洗1～2次，甩干。⑨脱水、封片。将切片依次置于75%、95%、100%的乙醇中，时间均为3 min，然后在组织中央滴一滴中性树脂，进行封片。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

KIAA1199主要定位于细胞质中，阳性为细胞质呈黄色。根据阳性细胞比例及染色强度进行评分。阳性细胞比例评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞比例﹤10%为1分，阳性细胞比例10%～50%为2分，阳性细胞比例51%～80%为3分，阳性细胞比例﹥80%为4分。染色强度评分：未着色计0分，为弱阳性（+）；淡黄色计1分，为阳性（++）；黄色计2分，为强阳性（+++）。阳性细胞比例评分与染色强度评分相乘，≥4分为高表达，﹤4分为低表达。

1.4 观察指标

比较NSCLC组织和癌旁组织中KIAA1199的表达情况，比较不同临床特征NSCLC患者NSCLC组织中KIAA1199的表达情况。所有患者均随访3年，比较KIAA1199高表达和低表达患者的3年总生存率。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示；以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 组织和癌旁组织中KIAA1199表达情况的比较

NSCLC组织中KIAA1199高表达率为74.19%（92/124），明显高于癌旁组织的35.48%（44/124），差异有统计学意义（χ2=37.513，P=0.001）。

2.2 不同临床特征NSCLC患者NSCLC组织中KIAA1199表达情况的比较

不同年龄、性别NSCLC患者NSCLC组织中KIAA1199表达情况比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。腺癌、低分化、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者NSCLC组织中KIAA1199高表达率分别高于鳞状细胞癌、高分化、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同临床特征NSCLC患者NSCLC组织中KIAA1199表达情况的比较

2.3 生存情况的比较

KIAA1199高表达患者的3年总生存率为22.83%（21/92），明显低于KIAA1199低表达患者的53.12%（17/32），差异有统计学意义（χ2=8.932，P=0.003）。

3 讨论

明确可以预测预后的分子标志物对肺癌患者治疗方案的制订和生存期的延长具有重要作用。影响肺癌预后的原因众多，机制烦琐。目前临床中发现基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可作为评估肺癌患者预后的重要指标[5]。MMP9表达水平与肺癌患者的TNM分期、淋巴结转移和复发情况相关。除MMP9外，在肺癌组织的肿瘤浸润环境中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MMP2等水解酶的活性较高，特别是外周血MMP9水平与肺癌的恶性程度有关，可为监测晚期肺癌患者的病情提供依据[6]。有研究指出，微小RNA（microRNA，miRNA）、环氧化酶 2（cyclooxgenase 2，COX2）、DNA修复基因等均与肺癌具有直接关系，但其判断预后的效果不佳[7-8]。肺癌标志物虽然很多，但目前为止还未发现诊断效能高的分子标志物，尽快找出明确的生物标志物对肺癌早期诊断及预后评估具有重要意义[9-10]。

KIAA1199基因最先在耳聋患者中发现，其在听力障碍者的耳蜗及内耳中表达异常活跃，与患者听力功能减退存在一定关联，故称为“耳聋基因”[11-12]。进一步研究指出，结肠癌组织中KIAA1199表达上调，涉及WNT通路的多个基因激活，且KIAA1199水平越低，WNT通路对肿瘤发生的影响越小，越能够抑制肿瘤进一步发展[13-15]。除大肠癌外，肝癌、胰腺癌、胃癌细胞中KIAA1199也呈高表达。研究发现，KIAA1199可与肺癌特异性结合多肽形成一种复合物，该复合物可提示早期肺癌的浸润深度[16-18]。

本研究探讨了KIAA1199在NSCLC组织中的表达情况及临床意义，结果发现，NSCLC组织中KIAA1199高表达率为74.19%，明显高于癌旁组织的35.48%，差异有统计学意义（P﹤0.01）。表明KIAA1199表达情况与NSCLC的发生有关。

KIAA1199蛋白可提高细胞耗氧需求进而造成缺氧，促使细胞迁移。同时KIAA1199可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），导致肿瘤细胞进一步扩散，但其对肺癌的具体作用机制仍未研究清楚。研究表明，KIAA1199可干扰WNT通路的活性，通过自身作用改变下游靶分子的功能，提高NSCLC细胞的侵袭能力，加速肿瘤细胞生长，促进正常细胞凋亡[19]。还有研究指出，在NSCLC中，miRNA-486-5p是改变KIAA1199活性的关键因子，其通过促进表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）表达使信号转导异常活跃，继而激活下游信号通路，阻止肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞再生长[20]。以上研究结果说明，KIAA1199在NSCLC发生发展中具有重要作用。本研究结果显示，腺癌、低分化、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者NSCLC组织中KIAA1199高表达率分别高于鳞状细胞癌、高分化、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。说明KIAA1199表达与NSCLC患者的病理类型、分化程度、淋巴结转移情况及TNM分期有关。KIAA1199高表达NSCLC患者的3年总生存率为22.83%，明显低于KIAA1199低表达患者的53.12%，差异有统计学意义（P﹤0.01），提示KIAA1199与NSCLC患者的预后有关。根据以上结果，下一步的研究可分析NSCLC治疗效果与KIAA1199表达情况的关系，根据KIAA1199的表达情况制订个性化治疗方案，探究是否可以提高疗效，改善生活质量。而另一方面，KIAA1199低表达患者的病情相对较轻，能否减少化疗疗程，仍需要进一步的临床试验数据支持。

综上所述，KIAA1199在NSCLC组织中高表达，其与NSCLC患者的临床特征及预后有关，可为预后评估提供依据。