张立坤，邵东风，王东海，李 扬

(1.唐山市协和医院耳鼻咽喉头颈外科，河北 唐山 063000； 2.华北理工大学附属医院呼吸与危重症医学科，河北 唐山 063000)

喉癌是具有早期淋巴结转移和高侵袭特性的恶性肿瘤，全球发病率估计为2.32/10万[1-2]。减轻患者病痛和经济压力尤为重要，寻找用于临床的有效药物显得极为迫切。绿原酸(chlorogenic acid，CGA)是具有悠久历史的中药多酚，金银花、杜仲、小粒咖啡和绿茶等植物中都含有该物质。目前，CGA的抗肿瘤、抗炎、抗真菌和抗氧化等方面的研究已有报道[3-4]。研究结果发现，CGA对乳腺癌等肿瘤的治疗有积极的影响[5]。然而，关于CGA对喉癌细胞影响的研究还未见报道。B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)在淋巴瘤细胞中被发现，当Bcl-2过表达时，能有效抑制细胞程序性死亡或者凋亡[6]。凋亡相关因子Bcl-2相关X蛋白(Bax)与Bcl-2具有氨基酸同源性，在体内Bax与Bcl-2可形成异型二聚体，过表达的Bax能有效抑制Bcl-2的活性[7]。Bax与Bcl-2是细胞凋亡重要的开关分子，其在恶性肿瘤细胞凋亡中具有重要的作用[8]。胱天蛋白酶(Caspase)家族主要通过线粒体通路、死亡受体通路促进细胞凋亡，Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键因子，具有蛋白失活和切割作用，激活Caspase-3蛋白后可促进细胞的凋亡[9]。本研究采用不同浓度CGA及Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路抑制剂处理喉癌Hep-2细胞，探究CGA对喉癌Hep-2细胞及Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路的影响，为临床治疗喉癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞:喉癌Hep-2细胞(批号为CCL-23)购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2 仪器：BPH-9162型细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Celldiscoverer 7型倒置显微镜(卡尔蔡司上海管理有限公司)；A49891型细胞计数器(美国赛默飞世尔科技有限公司)；SAF-680T型酶标仪(上海巴玖实业有限公司)；EX-1026型流式细胞仪、EL-3047型蛋白凝胶成像仪(常州必达科生物科技有限公司)。

1.1.3 药品与试剂：CGA(原料药，纯度为98.5%，批号为S30617-3)购自西安天广源生物科技有限公司；Bax/Bcl-2/Caspase-3通路抑制剂Bax inhibitor peptide V5(批号为A15337)购自南京百鑫德诺生物科技有限公司；DMEM培养液(批号为P-CA-307)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8，批号为P-CA-402)和细胞凋亡双染试剂盒(Annexin V-FITC/PI，批号为P-CA-201)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；蛋白提取试剂盒(批号为ab113476)购自美国Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号为GK10009)购自美国GlpBio公司；鼠源Bax(批号为sc-7480)、Bcl-2(批号为sc-7382)、Caspase-3(批号为sc-7272)、凋亡相关蛋白(p53，批号为sc-23900)、增殖相关蛋白(ki-67，批号为sc-1269)、GAPDH抗体(批号为sc-47724)和羊抗人二抗(批号为sc-51993)购自上海江莱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及含药培养液制备：取喉癌Hep-2细胞，于96孔培养板中，用90%DMEM培养基和10%胎牛血清，在37 ℃、5%二氧化碳与95%空气的条件下在培养箱中进行培养，细胞密度达到80%以上进行传代，每3 d更新1次培养液；倒置显微镜观察到细胞长满培养瓶。将CGA溶解于DMEM培养液中，配制成含有0、250、500、750和1 000 μmol/L的CGA培养液，用于后续实验[10]。

1.2.2 CCK-8法检测不同浓度CGA对喉癌Hep-2细胞增殖抑制率的影响：取对数生长期喉癌Hep-2细胞，调整喉癌Hep-2细胞浓度为2×105个/孔，接种于24孔培养板，分别用含有0、250、500、750和1 000 μmol/L的CGA培养液处理喉癌Hep-2细胞24、48 h，用CCK-8法检测喉癌Hep-2细胞增殖能力，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培养1 h后，于酶标仪(450 nm)中测定各孔吸光度(OD450)值，根据公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD450值/对照组OD450值)×100%，其中实验组为各浓度CGA培养液，对照组为0 μmol/L的CGA培养液，以此寻找出最适宜CGA的浓度和处理时间。实验重复6次。

1.2.3 细胞分组及处理：取对数生长期喉癌Hep-2细胞，分为对照组(正常培养的喉癌Hep-2细胞)、CGA低浓度组(CGA培养液750 μmol/L)、CGA高浓度组(CGA培养液1 000 μmol/L)、CGA高浓度+通路抑制剂组(CGA培养液1 000 μmol/L+Bax/Bcl-2/Caspase-3通路抑制剂Bax inhibitor peptide V5 50 μmol/L，Bax inhibitor peptide V5的浓度依据试剂盒说明书进行设置)，各组喉癌Hep-2细胞按照上述方式给药进行培养。

1.2.4 CCK-8法检测各组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率：取各组对数生长期喉癌Hep-2细胞，测定方法同“1.2.2”，分别在培养至48 h时测定于每孔细胞在450 nm处OD450值，并计算喉癌Hep-2细胞增殖抑制率。实验重复6次。

1.2.5 流式细胞仪检测各组喉癌Hep-2细胞凋亡情况：用胰蛋白酶消化各组喉癌Hep-2细胞，终止消化后用胎牛血清培养基进行培养，调整细胞密度为2×105个/mL，用PBS清洗2次，3 300 r/min离心(离心半径为15 cm)5 min去除上清液，加入500 μL稀释的膜联蛋白V结合缓冲液重悬细胞，再加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色，室温(25 ℃)避光孵育20 min后于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复6次。

1.2.6 蛋白质印迹法检测各组喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路相关蛋白表达：取各组喉癌Hep-2细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL接种于24孔板中，按照蛋白提取试剂盒操作流程提取各组喉癌Hep-2细胞的总蛋白，8 500 r/min离心(离心半径为15 cm)5 min取上清液，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作流程测定其中蛋白质含量，使用凝胶电泳1.5 h，分离等量蛋白质，转移至聚偏氟乙烯膜上，加入封闭液封闭1 h，添加鼠源p53(1∶ 300)、ki-67(1∶ 300)、Bax(1∶ 500)、Bcl-2(1∶ 500)、Caspase-3(1∶ 1 000)、GAPDH(1∶ 500)一抗孵育4 ℃过夜，添加羊抗人二抗(1∶ 2 000)后室温孵育2 h。采用蛋白凝胶成像仪对相关蛋白水平进行半定量分析。实验重复6次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度CGA对喉癌Hep-2细胞增殖抑制率的影响

与0 μmol/L CGA相比，250、500、750和1 000 μmol/L的CGA对喉癌Hep-2细胞增殖抑制率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且呈现浓度依赖性；其中750、1 000 μmol/L的CGA对喉癌Hep-2细胞增殖抑制率相对较高，因此，选择750、1 000 μmol/L的CGA用于后续的实验；与24 h相比，250、500、750和1 000 μmol/L的CGA对喉癌Hep-2细胞处理48 h后的增殖抑制率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，因此，后续实验对喉癌Hep-2细胞处理48 h，见表1。

表1 不同浓度CGA对喉癌Hep-2细胞增殖抑制率的影响Tab 1 Effects of different concentrations of CGA on proliferation inhibition rate of laryngeal cancer Hep-2

2.2 四组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率比较

与对照组相比，CGA低、高浓度组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率显著升高；CGA高浓度组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率高于CGA低浓度组；与CGA高浓度组相比，CGA高浓度+通路抑制剂组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率显著降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 四组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率比较Tab 2 Comparison of proliferation inhibition rate of laryngeal cancer Hep-2 cells among four groups n=6)

2.3 四组喉癌Hep-2细胞凋亡率比较

与对照组相比，CGA低、高浓度组喉癌Hep-2细胞凋亡率显著升高；CGA高浓度组喉癌Hep-2细胞凋亡率高于CGA低浓度组；与CGA高浓度组相比，CGA高浓度+通路抑制剂组喉癌Hep-2细胞凋亡率显著降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图1。

表3 四组喉癌Hep-2细胞凋亡率比较Tab 3 Comparison of apoptosis rate of laryngeal cancer Hep-2 cells among four groups n=6，%)

A.对照组；B.CGA低浓度组；C.CGA高浓度组；D.CGA高浓度+通路抑制剂组A. control group; B. CGA low concentration group; C. CGA high concentration group; D. CGA high concentration+pathway inhibitor group图1 四组喉癌Hep-2细胞凋亡流式图Fig 1 Flow cytometry of laryngeal cancer Hep-2 cells apoptosis among four groups

2.4 四组喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡相关蛋白表达水平比较

与对照组相比，CGA低、高浓度组喉癌Hep-2细胞中ki-67蛋白表达水平显著降低，p53蛋白表达水平显著升高；CGA高浓度组喉癌Hep-2细胞中ki-67蛋白表达水平低于CGA低浓度组，p53蛋白表达水平高于CGA低浓度组；与CGA高浓度组相比，CGA高浓度+通路抑制剂组喉癌Hep-2细胞中ki-67蛋白表达水平显著升高，p53蛋白表达水平显著降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图2。

表4 四组喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡相关蛋白表达水平比较Tab 4 Comparison of expression levels of proliferation and apoptosis related proteins in laryngeal cancer Hep-2 cells

A.对照组；B.CGA低浓度组；C.CGA高浓度组；D.CGA高浓度+通路抑制剂组A. control group; B. CGA low concentration group; C. CGA high concentration group; D. CGA high concentration+pathway inhibitor group图2 四组喉癌Hep-2细胞p53、ki-67蛋白质印迹图Fig 2 Western blotting of p53 and ki-67 in laryngeal cancer Hep-2 cells among four groups

2.5 四组喉癌Hep-2细胞Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路相关蛋白表达水平比较

与对照组相比，CGA低、高浓度组喉癌Hep-2细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低；CGA高浓度组喉癌Hep-2细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达水平高于CGA低浓度组，Bcl-2蛋白表达水平低于CGA低浓度组；与CGA高浓度组相比，CGA高浓度+通路抑制剂组喉癌Hep-2细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5、图3。

表5 四组喉癌Hep-2细胞Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路相关蛋白表达水平比较Tab 5 Comparison of expression levels of Bax/Bcl-2/Caspase-3 signal pathway related proteins in laryngeal cancer Hep-2 cells among four groups n=6)

A.对照组；B.CGA低浓度组；C.CGA高浓度组；D.CGA高浓度+通路抑制剂组A. control group; B. CGA low concentration group; C. CGA high concentration group; D. CGA high concentration+pathway inhibitor group图3 四组喉癌Hep-2细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白质印迹图Fig 3 Western blotting of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in laryngeal cancer Hep-2 cells among four groups

3 讨论

喉癌在头颈部恶性肿瘤中的发病率居第2位，喉癌的治疗需要考虑根治问题，还需要考虑保留喉功能，术后进行化疗辅助是一种公认的根治方法，寻找新型的化疗药，提高根治率和患者健康水平，保留喉功能显得尤为重要[11-13]。CGA可以减轻肺炎危害，影响肺炎中巨噬细胞由M1向M2极化，抑制炎症发生[14]；并被证明可以用于辅助治疗乳腺癌，对乳腺癌MCF-7细胞具有更强的抑制作用[15]。本研究结果显示，250、500、750和1 000 μmol/L的CGA均具有抑制喉癌Hep-2细胞增殖的作用，且具有浓度依赖性，其中750、1 000 μmol/L的CGA对喉癌Hep-2细胞的抑制作用较为显著，因此，选择750、1 000 μmol/L的CGA用于后续实验。使用750、1 000 μmol/L CGA处理喉癌Hep-2细胞48 h后，结果发现，与对照组相比，CGA低、高浓度组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率、细胞凋亡率显著升高，p53蛋白表达水平显著升高，ki-67蛋白表达水平显著降低，表明CGA可以显著抑制喉癌Hep-2细胞的增殖，促进其凋亡。

Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路与细胞的凋亡过程有密切关系，Bax的过表达能有效抑制Bcl-2表达，并能激活Caspase-3，激活后的Caspase-3导致染色质凝聚和核酸酶激活，进一步促进细胞凋亡，在细胞凋亡过程中Caspase-3发挥最后执行者的作用，而Bcl-2过表达时能有效抑制Bax和Caspase-3的表达，显著抑制细胞凋亡[16]。Bcl-2与Bax能够特异性结合而发挥抗凋亡作用，Bax、Bcl-2和Caspase-3能够发生级联反应促进细胞凋亡[17]。刘磊峰等[18]的研究结果发现，通过影响Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平，可以促进喉癌Hep-2细胞的凋亡。p53基因是肿瘤抑制基因的一种，当促进p53蛋白高表达时，能有效诱导细胞凋亡[19]；ki-67是细胞核中增殖能力的标志物，其高表达提示细胞具有活跃的增殖能力[20]。本研究结果显示，CGA低、高浓度组喉癌Hep-2细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平高于对照组，Bcl-2蛋白表达水平低于对照组，表明CGA可促进喉癌Hep-2细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达。本研究结果还发现，与CGA高浓度组相比，CGA高浓度+通路抑制剂组喉癌Hep-2细胞增殖抑制率、细胞凋亡率，p53、Bax和Caspase-3蛋白表达水平显著降低，ki-67、Bcl-2蛋白表达水平显著升高，表明Bax/Bcl-2/Caspase-3通路抑制剂Bax inhibitor peptide V5能够逆转CGA抑制喉癌Hep-2细胞增殖和诱导其凋亡的作用，因此，CGA可能通过激活Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路发挥抑癌作用。

综上所述，CGA可显著抑制喉癌Hep-2细胞的增殖，并促进其凋亡，可能与Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路激活有关，但影响喉癌增殖与凋亡的因素较多，信号通路纷繁复杂而且未进行体内验证，因此仍需进一步研究。