张 宁，郭亚丽，刘 建，彭艳茹，王玉光

(首都医科大学附属北京中医医院呼吸科，北京 100010)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、全身性自身免疫性疾病，以多关节对称性肿胀、疼痛等为主要临床表现，而肺部受累为其关节外常见表现，约发生在60%～80%的RA患者中，可导致间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)[1-4]。据相关报道，ILD是RA患者死亡的重要原因，其发病机制可能与肺间质有丰富的结缔组织以及充足的血液供应有关[5-8]。目前，RA-ILD尚无特异性的治疗药物，常见的为慢作用抗风湿药联合糖皮质激素或抗纤维化药物，但其不良反应有时让患者难以接受[3]。故仍需积极探索治疗RA-ILD的有效药物以及研究其作用机制，以更好地治疗该病。

从中医学来讲，RA属于“痹证”范畴，风寒湿等邪气侵袭是发病的主要原因之一，以关节肿痛、僵硬不适为主要症状，应为外痹；ILD属于“肺痹”范畴，主要发病原因之一为肺、脾、肾亏虚，症状以咳嗽、喘息、活动后加重为主，应为内痹，故RA-ILD属于内外合痹。桂枝芍药知母汤囊括了肢体痹与肺痹的治疗，充分体现了内外合痹的证治思想，故可用于RA-ILD的治疗。现代药理学研究结果显示，桂枝芍药知母汤可降低Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠模型血清中肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)1β、IL-6、IL-17和基质金属蛋白酶(MMP)等水平，诱导滑膜成纤维细胞凋亡等[9]。而TNF-α、IL-17和IL-1β等在RA-ILD的发生发展中起着重要作用，尤其是在成纤维细胞中[10-12]。本课题组在临床实践中发现，应用桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD的疗效良好，可改善患者肢体关节肿痛、咳嗽和喘息等症状，但其具体作用机制未知。目前，有不少研究报道应用网络药理学及分子对接相结合的生物信息学方法，可预测中药复方的活性成分、作用靶点以及潜在的作用机制[13-15]。故本研究运用网络药理学及分子对接技术对桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD的潜在作用机制进行全面探讨，为后期的实验研究以及临床推广应用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分收集与潜在作用靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)检索桂枝芍药知母汤的有效成分和潜在作用靶点。应用平台中“Igredient”功能选项，查找复方中的有效成分，同时将口服生物利用度(OB)、类药性(DL)各设为≥30%、≥0.18作为筛选条件；运用平台中“Related Targets”功能选项查找其所对应的作用靶点。运用“PERL”软件及脚本对所获得的药物成分及作用靶点进行合并。借助于Uniprot数据库将靶点基因名称进行标准化处理，以便后续研究。

1.2 RA-ILD潜在致病靶点筛选

将RA-ILD的英文全称作为关键词，分别从以下数据库对RA-ILD潜在致病靶点基因进行搜索并将结果导出：GeneCard数据库[筛选条件设为相关得分(Relevance score)≥1]及PharmGkb、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)、治疗靶点数据库(TTD)和DrugBank数据库。应用R×64 4.0.2软件将导出的结果取并集，并绘制可视化的韦恩图。

1.3 药物-疾病潜在作用靶点的整理

应用R×64 4.0.2软件将“1.1”项和“1.2”项中最终所获结果进行整理，并取交集，绘制韦恩图。

1.4 构建药物成分-疾病靶点调控网络图

应用Cytoscape 3.8.0软件将“1.3”项中的结果构建网络调控图。本研究的调控网络图分为2个部分，周边圆形代表中药化学成分，中心网格代表疾病靶基因。网格中节点大小代表与相连中药化学成分的数目，若节点越大，则说明与该基因相连的成分越多。周边圆形代表不同药物所含成分。用边来表示药物成分与疾病靶点之间的相互关系，同时依据网络度值(degree)的大小进行分类。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络与筛选核心基因

运用STRING数据库，设置物种条件为人，将“1.3”项中药物与疾病潜在作用靶点交集基因构建PPI网络图，并下载TSV格式文件。在上述操作中，设置置信度(high confidence)≥0.9，同时隐藏断开节点。运用Cytoscape 3.8.0软件中的CytoNCA插件对节点属性进行评分，包括“Degree centrality”(DC)、“Betweenness centrality”(BC)、“Closeness centrality”(CC)、“Eigenvector centrality”(EC)、“Network centrality”(NC)和“Local average connectivity”(LAC)。具有高DC、BC、CC、EC、NC和LAC值的节点，意味着其在网络中起着非常重要的作用。基于上述评分结果，筛选每个评分大于中位数的基因作为核心基因，并进行2次筛选，最终获得网络核心基因[16]。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

在富集分析中，Pvalue<0.05，Qvalue<0.05。将GO富集结果中富集最高的前10项和KEGG通路富集结果中富集最高的前30项以可视化图形表示出来。

1.7 药物主要有效成分-关键核心靶点基因分子对接验证

从PubChem数据库下载桂枝芍药知母汤主要有效成分的小分子配体2D结构，通过应用ChemOffice软件转化为3D结构。关键靶点基因的大分子蛋白受体从PDB数据库中获取，其中所含的小分子配体和水分子由Pymol软件去除，通过AutoDockTools进行预处理(包括加氢等)。采用Vina软件将大分子受体与小分子配体进行分子对接，同时分析其结合活性。

2 结果

2.1 桂枝芍药知母汤有效成分筛选与靶点预测

通过TCMSP数据库进行搜索共获得201个有效成分，其中桂枝7个，白芍13个，甘草92个，麻黄23个，生姜5个，白术7个，知母15个，防风18个，附子21个；同时，共获得3 018个预测靶点。将有效成分及靶点预测文件采用“PERL”软件及其脚本进行合并，应用Uniprot数据库及“PERL”软件进行标准化注释、删除无效及重复靶点，最终获得237个作用靶点。

2.2 桂枝芍药知母汤-RA-ILD共同靶点筛选

通过GeneCard数据库、PharmGkb数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库及TTD数据库分别获得RA-ILD潜在致病靶点2 008、402、0、0及6个，共获得2 293个RA-ILD潜在致病靶基因。经过整理、分析，得到166个“药物-疾病”的潜在共同作用靶点，见图1。

图1 桂枝芍药知母汤-RA-ILD潜在共同作用靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of potential interaction targets of Guizhi Shaoyao Zhimu decoction-RA-ILD

2.3 有效成分-核心靶点网络分析

活性成分-核心靶点网络图见图2。由图2可知，有效成分-核心靶点共有307个节点，其中来源于化合物的有141个，来源于基因的有166个。有效成分的degree越高，可能在桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD中发挥重要作用。排序结果显示，槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)和汉黄芩素(wogonin)的degree较高(degree≥30)。

图2 活性成分-核心靶点网络图Fig 2 Network diagram of active components-core targets

2.4 PPI网络及核心基因预测

运用STRING数据库构建PPI网络，见图3。利用网络拓扑结构筛选关键基因时，第1次筛选条件分别为BC≥57.49，CC≥0.18，DC≥7.5，EC≥0.04，LAC≥3.1，NC≥4，筛选结果共显示48个节点，313条边，得到48个核心基因；第2次筛选条件分别为BC≥14.97，CC≥0.55，DC≥11，EC≥0.11，LAC≥5.52，NC≥6.94，筛选结果显示17个节点，89条边，得到17个核心基因，包括信号转导及转录激活因子3(STAT3)、蛋白激酶B(Akt)1、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1和MAPK3等，见图4。

图3 PPI网络Fig 3 PPI network

图4 核心基因筛选Fig 4 Screening of core genes

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

经GO功能富集分析共得到2 762个富集结果，其中生物过程(BP)2 467个，其中对氧化应激反应、对营养水平的反应及对脂多糖的反应等是其主要生物调节过程；细胞组分(CC)87个，分子功能(MF)208个，见图5。经KEGG通路富集分析共得到170条通路富集结果，主要包括IL-17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路和JAK激酶-信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)信号通路等，提示桂枝芍药知母汤可能通过上述通路发挥对RA-ILD的治疗作用，见图6—7。

图5 GO功能富集分析Fig 5 Go function enrichment analysis

图6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

图7 JAK-STAT信号通路图Fig 7 Signal path diagram of JAK-STAT

2.6 有效成分-核心基因分子对接

选取degree≥30的药物有效成分(槲皮素、木犀草素、山柰酚和汉黄芩素)，分别与前4位核心基因STAT3、Akt1、MAPK1和MAPK3进行分子对接，结果显示，槲皮素、木犀草素、山柰酚和汉黄芩素分别与STAT3、Akt1、MAPK1和MAPK3的结合能均≤-29.26 kJ/mol，显示出良好的结合力，见表1、图8。

表1 中药有效成分与核心靶基因的分子对接结果Tab 1 Molecular docking results of effective components of traditional Chinese medicine and core target genes

A.槲皮素与STAT3；B.槲皮素与Akt1；C.槲皮素与MAPK1；D.槲皮素与MAPK3A.quercetin and STAT3；B.quercetin and Akt1；C.quercetin and MAPK1；D.quercetin and MAPK3图8 有效成分与核心靶基因的分子对接图(部分)Fig 8 Molecular docking diagram of active ingredients and core target genes (part)

3 讨论

本研究结果显示，桂枝芍药知母汤的有效成分包括槲皮素、木犀草素和山柰酚等。相关研究结果显示，槲皮素可通过作用于多种细胞因子、生长因子以及相关信号通路等发挥抗肺纤维化作用[17-18]。宋占帅[19]的研究结果显示，木犀草素具有抑制肺纤维化的作用。龚国清等[20]的研究结果显示，木犀草素可降低肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸含量以及转化生长因子-β1 mRNA的表达水平，延缓肺组织纤维化的进展。相关报道显示，抗氧化、抗炎及增强机体免疫功能等为山柰酚的主要功效[21]。故推测槲皮素、木犀草素和山柰酚等有效成分在桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD中发挥重要作用。

本研究通过PPI网络拓扑分析后预测出STAT3、Akt1和MAPK1等17个核心靶基因。转录调节因子STAT3在成熟组织功能中起着关键作用，包括抑制炎症和免疫反应，STAT3激活可促进RA成纤维细胞样滑膜细胞的增殖，在肺纤维化发病机制中也发挥重要作用[22-23]。Kuuliala等[24]的研究结果发现，RA患者中的单核细胞脂多糖(LPS)激发后可促使Akt的活化，并与疾病的活动程度相关。因MAPK1(ERK2)属于炎症和免疫反应的调节因子，参与了RA-ILD的发生[25-26]。由此，可推测STAT3、Akt1和MAPK1等核心靶基因在RA-ILD的发生发展中发挥重要作用，可能是治疗RA-ILD的潜在靶点。

GO功能富集分析结果显示，RA-ILD的发病机制可能涉及氧化应激反应、营养水平的反应和脂多糖的反应等生物过程。氧化应激是RA病理生理学的重要组成部分，在自身免疫性疾病中，免疫应答与内源性/外源性抗原的相互作用导致活性氧的产生，氧化应激过程可能与炎症和加速关节破坏呈正相关[27]。相关研究结果表明，动物模型中异常的抗氧化活性加剧了肺纤维化，活性氧产生的细胞外基质降解产物可通过影响上皮细胞、间充质细胞和炎症细胞活性来促进纤维化，在肺纤维化患者的肺中也发现了氧化应激的标志物[28]。若作为抗氧化剂辅助因子之一的营养素长期缺乏或与感染相结合可削弱免疫反应，进而引起炎症介质以及免疫细胞群的增多[29]。LPS可诱导释放IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症细胞因子，激活下游炎症相关信号通路[30-31]。MAPK信号通路包括细胞外信号相关激酶(ERK)1/2、p38MAPK和c-Jun NH2末端激酶(JNK)等，也已被证明与LPS诱导的炎症反应有关，可诱发RA-ILD[32-33]。

KEGG通路富集分析结果显示，桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD的作用机制可能与调控IL-17、PI3K-Akt、TNF以及JAK-STAT等信号通路表达密切相关。相关临床研究结果显示，IL-17在RA-ILD患者血清中的含量明显高于单纯的RA患者以及健康对照组，同时与肺功能具有一定的相关性[34]。菅向东[35]的研究结果显示，RA-ILD患者血清中TNF-α表达水平明显升高，同时在肺纤维化大鼠肺组织中TNF-α mRNA表达水平显著高于对照组。据相关报道，趋化因子配体中的CXCL16和CXCR6在器官纤维化中起着关键作用，而RA-ILD患者血清可溶性CXCL16水平显著升高，并与肺纤维化的严重程度相关，这与CXCL16/CXCR6轴通过PI3K-Akt-FOXO3a信号通路促进MRC-5细胞增殖和胶原生成有关[36]。在本病发生、发展中，若JAK-STAT信号通路功能失调，可持续释放MMP，使异常免疫细胞表达增多、凋亡软骨细胞增加，从而诱发疾病，甚至加速病情进展[37]。分子对接结果显示，槲皮素、木犀草素、山柰酚和汉黄芩素分别与STAT3、Akt1、MAPK1和MAPK3相结合后，均展现出具有良好的亲和力，这也充分验证了本研究的成果。

本研究预测了桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD的可能作用机制，其涉及多靶点以及多条信号通路，为后期进一步的实验研究以及临床推广应用奠定了基础，也为医者应用桂枝芍药知母汤治疗RA-ILD提供了一定的依据。但本研究仍存在一定局限性，有待相关基础实验进行验证。