陆小琴 雷娇娇 刘雨欣 赵华清

急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)主要由骨髓和外周血中的T淋巴细胞异常增生所致[1]，好发于儿童，病情进展迅速，发病率有逐渐升高的趋势[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200 bp的RNA，参与机体细胞正常生理过程及肿瘤的发生发展过程。lncRNA-X失活特异性转录本(lncRNA-XIST)在喉鳞状细胞癌、骨肉瘤和胶质母细胞瘤等疾病中促进肿瘤的发生发展[3]，但lncRNA-XIST在T-ALL中作用的研究鲜有报道。

miR-375是新近发现的一种miRNA，在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用，表达水平与癌症患者生存率相关[4]。Notch信号激活与肿瘤有密切的联系，Notch配体-受体结合或Notch基因突变可激活Notch信号[5]。Notch1与T-ALL的发生发展有关，通过调控Notch1的表达能够影响肿瘤细胞的增殖和侵袭能力[6]。生物信息分析显示miR-375是lncRNA-XIST的潜在靶点，miR-375与Notch1可能存在结合位点。基于此，我们推测lncRNA-XIST可能通过miR-375-Notch1轴调控T-ALL细胞增殖与侵袭。因此，本研究探讨lncRNA XIST通过miR-375-Notch1轴调控对T-ALL细胞增殖、侵袭的作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织样本

选择2018年6月—2021年3月于重庆大学附属三峡医院确诊的T-ALL患者57例为观察对象(T-ALL组)，其中男35例，女22例，年龄8～35岁，平均(23.32±7.36)岁，患者均依据世界卫生组织修订的急性淋巴细胞白血病的分类和诊断标准进行诊断[7]。另选55例健康体检者为对照组，其中男34例，女21例，年龄9～34岁，平均(23.83±6.97)岁。纳入标准：(1)近3个月无感染；(2)近1个月无出血；(3)近1个月未服用免疫抑制剂。两组性别和年龄等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医学伦理委员会同意(伦理编号：LL-2022-02)，所有纳入对象入组后，均详细告知实验目的、研究性质，并自愿签署知情同意书。

1.2 试剂和材料

人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞细胞株(CCRF-CEM)(美国ATCC细胞库)；淋巴细胞分离液(美国GE公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；si-lncRNA XIST及其各自的阴性对照(GenePharma，中国上海)；TRIzol(美国Invitrogen公司)；M-MLV逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；miR-375、Notch1扩增引物(上海生工)；miR-375 mimic和miR-NC(广州锐博生物公司)，Lipo8000转染试剂(碧云天)；β-action单克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(碧云天生物科技有限公司)；Notch1、Hes1、ADAMl7多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3 细胞培养及转染

CCRF-CEM细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640进行培养，培养条件为37℃，5% CO2饱和湿度。以CCRF-CEM细胞为对照(Control组)，在CCRF-CEM细胞中转染si-lncRNA XIST(si-lncRNA XIST组)、si-NC(si-NC组)，及miR-375 mimic(miR-375组)和miR-NC(miR-NC组)。具体方法如下：Lipo8000转染试剂(5 μL)与载体DNA混匀(5 μL)，室温放置15 min，然后加至处于对数生长期的细胞，培养8 h后更换含血清的完全培养液，48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4 逆转录和定量实时PCR

取T-ALL组和对照组的外周静脉血3～5 mL，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，TRIzol法提取总RNA；收集CCRF-CEM细胞，TRIzol法提取总RNA。检测RNA浓度，逆转录cDNA，-20℃保存待测。实时定量PCR反应体系：2.5 μL引物，2.5 μL的cDNA，12.5 μL的qPCRmix(含荧光染料)，dd水补足至25 μL；XIST PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环；miR-375 PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；Notch1 PCR反应条件：94℃ 4 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 60 s，30个循环。GAPDH和U6作为参考基因，以2-△△Ct计算相对含量。引物设计见表1。T-ALL组和对照组均完成PCR检测，细胞株进行三次独立重复实验。

表1 各基因引物序列

1.5 免疫印迹

收集T-ALL组和对照组外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞；收集完成转染等处理的CCRF-CEM细胞。RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，分离、转膜，5%脱脂乳封闭3 h，添加兔抗人ADAM-17、Notch1、Hes1及β-action一抗(1∶1 000)，在4℃孵育过夜。TBST冲洗3次，添加HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h。使用PierceTMECL显影，分析条带灰度值。进行三次独立重复实验。

1.6 细胞增殖

分别收集转染并培养0、24、48、72和96 h的CCRF-CEM细胞，以每孔2×103个细胞接种至96孔细胞培养板上。每孔添加10 μL CCK-8溶液，37℃孵育2 h。使用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度OD值。进行三次独立重复实验。

1.7 侵袭实验

分别收集转染并培养24 h的CCRF-CEM细胞，将完全培养液与基质胶按照1∶9比例配制混合液，以100 μL/孔加入Transwell小室内，每个小室接种5×104个细胞，下室用500 μL培养基(含10%FBS)做诱导趋化因子，置于37℃培养箱内培养。4 h后取出，棉签擦拭小室内膜，甲醛固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS冲洗3次，拍照，用显微镜计数3个视野的细胞数目。进行三次独立重复实验。

1.8 细胞凋亡

收集细胞，制备成每1 mL含106个细胞的细胞悬液，加入细胞培养液1 mL，1 000×g离心10 min，弃去上清，依次加入Binding Buffer 400 μL、Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。进行三次独立重复实验。

1.9 荧光素酶试验

扩增XIST野生型(WT)或突变型(MUT)片段、Notch1 mRNA 3′UTR和突变3′UTR片段，连接到荧光素酶载体对照载体的下游[8]。将lncRNA XIST-WT、lncRNA XIST-MUT与miR-NC(XIST-WT+miR-NC组，XIST-MUT+miR-NC组)或miR-375(XIST-WT+miR-375组，XIST-MUT+miR-375组)共转染至CCRF-CEM细胞中。转染后48 h收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。进行三次独立重复实验。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 lncRNA XIST、miR-375、Notch1 mRNA和Notch1蛋白的表达

T-ALL组患者外周血单核细胞及CCRF-CEM细胞株中lncRNA XIST、Notch1 mRNA水平明显高于对照组，miR-375水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。T-ALL组患者外周血单个核细胞Notch1蛋白高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)(图1)。

图1 lncRNA XIST、miR-375、Notch1 mRNA和Notch1蛋白的表达

2.2 转染si-lncRNA XIST后CCRF-CEM细胞生物学活性变化

对CCRF-CEM细胞转染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST。与对照组比较，转染si-lncRNA XIST后细胞增殖率及细胞侵袭数量下降，差异有统计学意义(P<0.05)，细胞凋亡数量增加，差异有统计学意义(P<0.001)(图2)。

图2 转染si-lncRNA XIST对CCRF-CEM细胞增殖、凋亡和侵袭影响

2.3 miR-375的靶标分析

将lncRNA XIST-WT、lncRNA XIST-MUT与miR-NC或miR-375共转染至CCRF-CEM细胞中。结果显示，lncRNA XIST-WT+miR-375的荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(P<0.001)(图3)。表明miR-375是lncRNA XIST靶标。

图3 荧光素酶报告实验

2.4 过表达miR-375对CCRF-CEM细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响

对CCRF-CEM细胞转染miR-375 mimic以上调细胞miR-375(图4A)。细胞增殖实验结果显示在转染miR-375后48、72及96 h三个时间点的OD值低于对照组和miR-NC组(图4A)，差异有统计学意义(P<0.05)；转染miR-375后细胞凋亡率高于对照组和miR-NC组(图4B)，差异有统计学意义(P<0.001)；转染miR-375后细胞穿过Transwell小室细胞的平均个数较对照组和miR-NC组下降，差异有统计学意义(P<0.001)(图4C)。

图4 转染miR-375 mimic对CCRF-CEM细胞增殖、凋亡和侵袭影响

2.5 lncRNA XIST对miR-375、Notch1表达的调控

通过转染si-lncRNA XIST以沉默lncRNA XIST，分析lncRNA XIST对下游miR-375、Notch1的调控作用。转染si-lncRNA XIST后，miR-375升高，差异有统计学意义(P<0.05)；而Notch1 mRNA水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)(图5A)。此外，沉默lncRNA XIST后Notch1、ADAM-17及Hes1蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)(图5B)。

图5 沉默lncRNA XIST对miR-375、Notch1表达的影响

3 讨论

lncRNA XIST是一种致癌lncRNA，在骨肉瘤、甲状腺癌、食管癌等恶性肿瘤中高表达[9-11]，通过对多种肿瘤的细胞增殖、细胞周期、细胞侵袭的影响，起到促癌作用，但在T-ALL患者中表达是否异常，目前尚未见报道。本研究发现T-ALL患者lncRNA XIST较健康对照人群显著升高，并且T-ALL细胞株CCRF-CEMC细胞的lncRNA XIST水平也显著升高，提示高水平lncRNA XIST可能在T-ALL发病过程中发挥重要作用。本研究通过沉默RNA(si RNA)沉默lncRNA XIST，发现肿瘤细胞增殖能力、侵袭能力明显下降，而细胞凋亡明显增加，表明lncRNA XIST参与T-ALL发病，起促癌作用。

lncRNA通常不直接作用于靶基因，而是通过另一种非编码RNA(miRNA)靶向调控终端蛋白表达发挥功能。miR-375是lncRNA XIST下游靶点之一，通过miR-375可调控Wnt1、p53、TET1等信号通路，影响肿瘤细胞生长、侵袭和转移[12-13]。本研究结果显示，在T-ALL患者和T-ALL细胞株CCRF-CEMC中miR-375水平均显著下降，与lncRNA XIST表达趋势相反。为了证实在T-ALL中miR-375是否是lncRNA XIST的作用靶点，我们首先通过生物信息学预测发现lncRNA XIST与miR-375存在结合位点，进而通过荧光素酶报告实验证实miR-375是lncRNA XIST下游靶点。进一步研究发现，转染miR-375模拟物上调肿瘤细胞miR-375水平后，肿瘤细胞增殖能力、侵袭能力明显下降，细胞凋亡明显增加。表明lncRNA XIST通过抑制miR-375参与T-ALL发生进展。

Notch1信号通路在T-ALL的发病过程中发挥重要作用[14]。Notch1的异常与T细胞前体的分化与发展关系密切，Notch1是miR-375下游的调控靶点，该信号轴在口腔鳞状细胞癌等恶性肿瘤中得到证实[15]。本研究结果显示，Notch1的mRNA、蛋白水平在T-ALL患者中都明显升高，与Mansur等[16]的研究结果相符。在沉默lncRNA XIST后，miR-375水平明显增加，而Notch1的mRNA和蛋白水平明显下降，此外Notch1轴相关蛋白ADAM-17、Hes1水平也明显下降，表明lncRNA XIST对下游miR-375、Notch1具有调控作用：lncRNA XIST可能通过下调miR-375水平以增加Notch1表达，从而促进T-ALL肿瘤细胞的生物学活性，导致T-ALL发生发展。

综上所述，本研究发现lncRNA XIST调控miR-375-Notch1信号轴，在T-ALL细胞增殖、侵袭和凋亡等细胞生物学行为中发挥重要作用，为探索T-ALL潜在治疗靶点提供了新思路。但是本研究存在样本量小的不足，同时，lncRNA调控通路复杂，其可能存在有多个靶向miRNA。因此，后续研究中我们将进一步扩大样本量，并验证lncRNA XIST更多的调控途径。