陈 科，陈继军，陈赵乐，樊菲菲，刘传明

（解放军空军军医大学第一附属医院急诊科，陕西 西安 710032）

胃癌（gastric cancer，GC）是最为常见的消化道恶性肿瘤之一。流行病学数据显示，2020 年美国GC新确诊患者27 600 例，当年病死于胃癌者11 010例，GC 已成为癌症相关死亡的主要原因之一[1，2]。目前我国GC 患者整体预后较差的主要原因为早期诊断不完善，早期或超早期患者比例较少，胃癌患者常发现于晚期，大多已出现远处转移或区域淋巴结转移[3]。因此，探索新的与胃癌发生发展密切相关的基因，对于开发新的胃癌患者预后或治疗反应率的生物学分子标志物，以及可能成为胃癌靶向分子的意义重大。本研究通过公共数据库探讨肉碱棕榈酰转移酶1C（carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C）在胃癌组织中的基因表达水平和与甲基化的关联，及与患者临床病理特征和预后的关系，并通过GSEA富集分析对CPT1C 可能参与的信号通路进行分析，以期为CPT1C 在胃癌中的研究提供依据和方向。

1 材料与方法

1.1 TCGA 资料下载 从TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）下载有关胃癌的表达谱数据和临床表型数据，采用R 语言（版本：3.5.1）提取CPT1C 数据，分析其表达水平与临床病理参数及预后的关系。

1.2 TCGA 数据处理和分析 删除胃癌患者中生存时间＜30 d 的样本，以CPT1C 表达量的中位数将其分为高表达组和低表达组。然后使用GSEA 4.0.1 软件对高表达组和低表达组的样本进行基因集富集分析，其中c2.cp.kegg.v 6.0.symbols.数据集从GSEA 网站的MisgDB 数据库获取，采用缺省加权富集统计方法进行富集分析，设置随机组合次数为1000 次。最后使用R 语言的ggplot2 包进行多GSEA 富集分析的图形绘制。

1.3 Kaplan-Meier Plotter 数据分析 在Kaplan-Meier Plotter 数据分析平台中检索CPT1C 基因，并应用在线分析软件绘制CPT1C 高低表达的生存曲线，限定条件为总生存和无疾病进展生存，对肿瘤病理类型、临床分期、分级等不做限制。探索CPT1C 的表达与性别、TNM 分期、劳伦分型、HER2 状态等胃癌临床病理因素的关系。

1.4 DNMIVD 数据分析 在DNA 甲基化交互可视化数据库（DNMIVD）中，分析CPT1C 基因甲基化与mRNA 表达水平的关联。并依据CPT1C 基因的甲基化水平将其分为高/低甲基化两组，比较CPT1C 甲基化水平与胃癌患者预后的联系。

1.5 统计学方法 采用Wilcoxon 秩和检验对胃癌和癌旁组织中CPT1C 基因表达量进行差异分析。采用R 语言，survival 数据包，进行生存分析并绘制生存曲线，采用Log-rank 检验对生存率进行比较。采用R3.5.1 统计学软件进行差异表达基因分析及图形的绘制。采用GSEA 4.0.1 软件进行基因集富集分析，其中将错误发现率（FDR）＜0.05 的基因集作为显著富集基因集。

2 结果

2.1 CPT1C 的表达水平与胃癌预后的关系 对来自TCGA 数据库中的343 例胃癌组织和30 例癌旁组织的CPT1C 基因表达量进行差异分析，结果显示，与癌旁组织相比，CPT1C 在胃癌中显著高表达，差异有统计学意义（P=0.003），见图1。之后将生存时间＜30 d 的样本删除后，共有306 例癌样本，以CPT1C 基因表达的中位数为分界点，将胃癌患者分为CPT1C 高表达组（n=153）和CPT1C 低表达组（n=153）。生存分析结果显示，CPT1C 高表达组患者的预后更差，其中位生存时间为396 d，CPT1C 低表达组患者的中位生存时间为463 d，差异有统计学意义（Log-rank 检验，P=0.01），见图2。之后在Kaplan-Meier Plotter 数据库中，同样观察到高表达CPT1C胃癌患者与不良预后显著相关，见图3。

图1 CPT1C 在343 例胃癌和30 例癌旁组织中的差异表达

图2 TCGA 胃癌患者中CPT1C 高低表达的生存曲线

图3 CPT1C 高低表达胃癌患者生存曲线

2.2 CPT1C 表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系 Kaplan-Meier Plotter 数据库中，以胃癌组织中CPT1C 表达水平的中位数为界，将患者分为CPT1C高表达组和CPT1C 低表达组，探索CPT1C 的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系。在总生存分析组中，胃癌组织中CPT1C 表达与患者性别、TNMⅢ期、T3、N 分期（N1、N2和N1+2+3）、劳伦分型（肠型）和HER2 阴性有关（P＜0.05），而与TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ期）、T 分期（T2和T4分期）和分化程度等临床病理因素无明显相关性（P＞0.05）。在无病生存期分析组中，胃癌组织CPT1C 表达与男性患者、TNMⅢ期、T3、N 分期（N1+2+3）、劳伦分型（肠型）和HER2 阴性有关（P＜0.05），而与女性、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ期）、T 分期（T2和T4分期）和分化程度等临床病理因素无明显相关性（P＞0.05），见表1。

表1 Kaplan-Meier plotter 探索不同临床病理因素对胃癌CPT1C 基因表达及临床预后的影响

2.3 影响胃癌患者总生存的单因素和多因素Cox 回归分析 对来自TCGA 的胃癌患者进行单因素Cox回归分析见表2，结果显示高表达CPT1C 的患者与不良预后显著相关（HR=1.43，P=0.02）。其他临床病理因素如：年龄、性别、TNM 分期、N 分期、肿瘤状态和残余肿瘤也与胃癌患者总生存有明显相关性（P＜0.05）。此外，多因素Cox 回归分析结果显示，高表达CPT1C 和带瘤状态仍与胃癌患者不良预后相关（P＜0.05）。综合以上结果提示CPT1C 的表达水平能够成为影响胃癌患者生存的独立预后因素，并且高表达CPT1C 与不良预后相关。

表2 影响胃癌患者的总生存单因素和多因素回归分析

2.4 CPT1C 的甲基化水平及其与预后的关系 利用DNMIVD 探讨CPT1C 的表达水平与启动子甲基化水平的相关性，结果显示：CPT1C 启动子甲基化β值与基因表达水平呈负相关（r=0.33，P=6.60e-10）。并且将根据CPT1C 甲基化中位值分为高/低甲基化表达组，可以观察到高甲基化表达组的患者预后更好（P＜0.05），见图4。

图4 CPT1C 表达量与启动子甲基化水平的相关性及其总体生存期的关系

2.5 CPT1C 功能的基因富集分析 GSEA 分析结果显示，CPT1C 高表达样本富集了ECM 受体相互作用、Ca 离子信号通路和HEDGEHOG 信号通路等相关基因集，而CPT1C 低表达样本则富集了剪接体、碱基切除修复和氧化磷酸化等相关基因集，见图5。

图5 胃癌患者中CPT1C 高、低表达样本的GSEA 富集分析

3 讨论

代谢重编程作为癌症的特征之一[4，5]，为癌细胞的生长、分裂和生存提供所需的能量和物资。脂肪酸氧化代谢在癌症中的重要性，已经引起研究者的关注，其不仅参与癌症转移微环境的形成，而且对癌细胞的增殖、生存和耐药性有重要作用[6-9]。肉毒碱棕榈酰转移酶1（Carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）是控制脂肪酸氧化代谢的主要因子[10-12]。CPT1基因家族共包括3 个基因成员（CPT1A、CPT1B 和CPT1C），其中CPT1C 位于人类第19 号染色体上，于2002 年首次并且最后一个被发现的CPT1 家族成员，其主要分布在内质网和线粒体上。既往研究表明其在多种肿瘤中表达明显上调，并参与肿瘤的增殖和转移[13-15]。Rui W 等[13]研究发现，CPT1C 在甲状腺乳头状癌中高表达，并且CPT1C 的表达上调可促进癌细胞增殖和转移。Wan Y 等[14]研究显示，CPT1C 可能通过线粒体相关代谢重编程调控肿瘤细胞增殖和凋亡。并且近期研究提示[15]，通过代谢组学分析，观察到，相比于正常生长的PANC-1 细胞衰老的胰腺癌PANC-1 细胞系中CPT1C 的表达和活性降低。而且在小鼠模型中，敲除多种癌细胞系的CPT1C 表达，能引起线粒体功能障碍，导致生长抑制和细胞衰老，抑制代谢应激下的细胞存活，从而抑制肿瘤的发生和进展，预示其可能成为潜在肿瘤治疗靶点。此外，有研究发现CPT1C 在结肠癌组织中高表达，并且与不良预后相关[16]。这些研究表明CPT1C 在胃癌发生发展中有重要作用，可能作为治疗的潜在靶点和预测预后的标志物。

TCGA 是目前世界上最大的癌症基因信息数据库，包含了30 多种癌症的多组学数据和尤其宝贵且 详细的预后随访信息；Kaplan-Meier Plotter 数据库[17]的来源包括GEO（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），EGA（European Genome-phenome Archive，https://ega-archive.org）和TCGA。这些数据库为发现分析预后标记物的发现和验证、肿瘤基因组的改变以及研究其生物学分子机制提供海量的数据。本研究对TCGA 和Kaplan-Meier Plotter 数据平台中的胃癌患者CPT1C 基因表达数据进行分析，结果显示胃癌组织中的CPT1C 表达水平在癌组织中显著高于癌旁正常组织，其高表达与患者的不良预后和部分临床病理因素（男性、TNMⅢ期、T3、N1+2+3、肠型和HER2 阴性）显著相关，表明CPT1C 很可能为癌基因，且通过单因素/多因素回归分析发现，CPT1C 高表达组依然比低表达组预后更差。同时本研究中的数据来自TCGA、GEO和EGA，纳入的大量胃癌样本，数据可重复性高，具有较高价值，提示CPT1C 可能是胃癌的独立预后标志物。

目前CPT1C 基因参与胃癌发生发展及被调控机制尚不明确，DNA 甲基化是调控基因表达的一种重要方式。有研究通过分析DNMIVD 在线数据库发现[18，19]，CPT1C 启动子甲基化β 值与基因表达水平呈显著负相关，并且低甲基化水平的CPT1C 患者预后较低甲基化组更差，这与本研究中CPT1C 高表达预后不良一致，提示CPT1C 的表达，可能受表观遗传的调控，并对胃癌的预后有重要影响。同时利用GSEA 富集分析发现，CPT1C 高表达组主要富集在ECM 受体相互作用、Ca 离子信号通路和HEDGEHOG 信号通路，这是与既往报道[14，20，21]的CPT1C 主要通过脂质代谢发挥重要作用不同，也为未来进一步研究CPT1C 在胃癌中的作用机制提供一定依据和方向。

综上所述，CPT1C 在胃癌肿瘤组织中高表达，并与患者预后不良相关，其表达水平可能受DNA 甲基化调控，且可能通过ECM 受体相互作用、Ca 离子信号通路和HEDGEHOG 信号通路等通路发挥作用，可作为预测胃癌预后的生物标志和潜在的治疗靶点。