柏 鑫，侯雪峰，何文芳，何癑颖，王中琪，吴 西，陈克明

（1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730030；2.解放军联勤保障部队第九四〇医院基础医学实验室，甘肃 兰州 730050）

皮肤是人体最大的器官，具有保护、感觉、分泌、排泄、呼吸等功能，具有重要的屏障保护作用[1]。由于皮肤直接与外界环境接触，因而皮肤创伤也是临床上常见问题之一。据统计[2]，在美国，受到伤口长期难以愈合影响的人数超过650 万，年治疗费用超过97 亿美元。近年来，针对慢性难愈合创面的研究不断深入，其治疗手段也逐渐丰富，如负压封闭引流技术、血小板血浆、外用重组人表皮生长因子、自体全血及各种功能性敷料等都取得了较好的治疗效果[3-6]。光生物调节疗法（photobiomodulation therapy，PBMT）是一种安全、无痛、易操作的治疗手段，主要利用光的辐射能治疗疾病。研究表明[7]，PBMT 能够减轻创面疼痛、促进创面血管新生、调节免疫反应、加快组织愈合和再生。目前PBMT 的光源类型包括低水平激光（low-level laser，LLL）及发光二极管（light-emitting diode，LED）光源[8]，而且对于PBMT的研究也更多集中于LLL 上。为研究LED 多波段光谱治疗能否促进大鼠皮肤创伤愈合，本研究采用LED 多波段光谱治疗仪照射大鼠小面积全层皮肤缺损创面，检测其对大鼠皮肤创伤愈合的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂 LED 多波段光谱治疗仪（河北奥特维力科技有限公司）；组织匀浆仪（上海净信实业发展有限公司）；荧光酶标仪（美国美谷分子公司）；电泳仪，凝胶成像分析系统，半干转膜仪（美国BIO-RAD）；病理切片扫描仪（山东志盈医学科技有限公司）；自制直径18 mm 打孔器；4%多聚甲醛中性组织固定液（塞维尔生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（索莱宝科技有限公司）；免封闭PAGE 凝胶快速制备试剂盒（10%），彩虹180kd 广谱蛋白Marker（上海翊圣生物科技有限公司）；VEGF 抗体（美国Santa cruz 公司）；EGF、TGF-β1抗体（美国affinity 公司）;β-actin 抗体（英国abcam公司）。

1.2 动物分组与处理 50 只雄性Wistar 大鼠，体重（200±10）g，购自解放军联勤保障部队第九四〇医院实验动物中心，许可证号：SCYK（军）2017-0023，适应性喂养1 周后建立大鼠小面积全层皮肤缺损创伤模型，再按照随机数字表法分为模型对照组（model control group，MC）、LED 治疗组（light-emitting diode treatment group，LEDT）、红外线治疗组（infrared，IR）、红光治疗组（red light，RL）和紫外线治疗组（ultraviolet，UV），每组10 只。各治疗组大鼠暴露于对应光源下照射20 min，模型对照组大鼠放入治疗仪但不通电，2 次/d。其中，LEDT 由IR、RL 及UV 三种光源的混合光组成，具体光源参数见表1。本研究经过医院伦理委员会批准，动物伦理审批编号：2020KYLL128。

表1 LED 多波段光谱治疗参数

1.3 造模方法 按照赵京禹等[9]的方法建立大鼠小面积全层皮肤缺损创面模型。大鼠麻醉后将背部剃毛，面积约7 cm×5 cm，在后背中部脊柱两侧各旁开1 cm，距肩胛骨以下2 cm 处使用直径18 mm 的圆钻垂直于皮肤压出圆形痕迹（面积2.54 cm2），再使用手术剪沿压痕剪去全层皮肤，深达筋膜层，纱布压迫止血备用。每只大鼠制备1 个创面，由于皮肤的牵拉，造模后创面的面积约为3.675 cm2。

1.4 观察指标

1.4.1 创面面积测量 在创伤造模后的即刻及干预的第3、7、14 天后，将大鼠麻醉，在固定的高度与角度下对创面进行拍照记录。利用Photoshop 裁剪图片，利用Image-Pro Plus 对创面面积进行计算。创面愈合率=（初始面积-当日面积）/初始面积×100%。

1.4.2 组织病理学检测 治疗第3、7、14 天后，随机从各组中取3 只大鼠，将创面剪下，置于4%多聚甲醛中性组织固定液中固定48 h，然后进行石蜡包埋、切片，以及HE 染色处理。将制作好的切片置于病理切片扫描仪下观察组织病理病理学变化。

1.4.3 蛋白免疫印迹 治疗第14 天后，对创面中表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）以及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的蛋白表达量进行检测。随机从各组中取3 只大鼠，将创面剪下，液氮冷冻后置于组织研磨仪中研磨3 次，90 s/次，研磨后按比例加入高效组织蛋白裂解液冰上裂解30 min，裂解完成后12 000 r/min离心30 min，收集上清液放置于冷冻工作站。使用BCA 法检测样品中蛋白浓度，完成蛋白定量检测后加热变性，-80 ℃保存。检测时应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒配置10%的分离胶和5%浓缩胶，待其凝固后取5 μl 变性蛋白上样，电泳完成后使用干转膜仪进行转膜，脱脂奶粉封闭2 h，按照抗体说明在对应的一抗稀释液中4 ℃孵育过夜，次日，复温1 h 后使用TBST 清洗5 次，10 min/次。二抗按照来源不同分别使用山羊抗兔与山羊抗鼠，按照1∶10 000 稀释，将按照属性对应加入蛋白孵育盒中，摇床震荡孵育2 h 后，使用TBST 溶液清洗，清洗完成后进行曝光。利用Photoshop 软件统一裁剪条带，Image J 软件对图像进行灰度值定量分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以（）表示，采用t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义，P＜0.01 表示统计学意义显著。

2 结果

2.1 大鼠创面愈合率比较 随着时间延长，各组大鼠创面逐渐愈合。治疗第3 天，各组大鼠创面均已结痂（图1A），其中LEDT 组、IR 组、RL 组和UV 组创面愈合率高于MC 组（P＜0.05，图1B）；治疗第7 天，LEDT 组、IR 组、RL 组创面愈合率均高于MC 组（P＜0.05），但UV 组与MC 组创面愈合率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图1C）；治疗第14 天，LEDT 组、IR 组、RL 组和UV 组创面愈合率高于MC 组（P＜0.05），其中RL 组的愈合率最高（图1D）。

图1 LED 多波段光谱治疗对创面愈合率的影响

2.2 创面HE 染色结果 治疗第3 天，各组大鼠创面均有结痂覆盖创面，创面可见大量炎性细胞浸润；治疗7 天后可见表皮层明显增厚，LEDT 组、IR 组、RL组和UV 组的炎性细胞已逐渐减少，成纤维细胞等修复细胞逐渐增多，角质形成细胞由圆形变为长条形增生活跃，而MC 组的炎性细胞较多，成纤维细胞数量相对较少；治疗14 天后，LEDT 组、IR 组、RL 组和UV 组的创面已经由再上皮化组织覆盖整个创面，可见新生毛囊结构，MC 组部分再上皮化组织不连续，再生不完全，见图2。

图2 各组不同时间点HE 染色结果比较

2.3 各组大鼠创面EGF、TGF-β1、VEGF 表达水平比较 治疗第14 天后，LEDT 组、IR 组、RL 组和UV 组EGF、VEGF、TGF-β1表达量均高于MC 组（P＜0.01），但LEDT 与IR 组TGF-β1比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 LED 多波段光谱治疗对大鼠创面EGF、TGF-β1、VEGF 表达水平的影响

3 讨论

皮肤创伤愈合是一个复杂而连续的过程，主要包括炎症期、增生期和重塑期，这几个过程相互重叠，其中任何一个过程异常或时间延长均会导致伤口愈合的延迟。创伤早期伤口局部组织遭到破坏，多伴有组织坏死和血管的破裂，短时间即会出现炎症反应。创伤早期组织主要以炎症细胞为主，有利于异物及坏死组织的吞噬，同时伤口中的血液和渗出液中的纤维蛋白原形成凝块，在创伤表面结痂，能够对伤口起到保护作用。炎症反应后成纤维细胞等修复细胞在损伤部位大量增多，创面由新生的肉芽组织逐渐覆盖，同时伤口边缘新生的肌纤维母细胞产生牵拉作用，引起伤口的收缩，加快创面的修复。肉芽组织表面则由角质形成细胞迁移和增生为主的表皮，通过再上皮化进程覆盖肉芽组织进而完成组织的修复。创面完全覆盖后，幼稚肉芽组织逐渐经过组织改建转变为瘢痕组织，而后还会经过较为漫长组织改建的过程，即组织重塑期[10]。

随着现代光医学的发展，PBMT 的应用越来越广泛，研究证明PBMT 具有减轻炎症反应、降低疼痛、增加循环血量及促进组织修复等多种治疗作用，在创面修复领域中应用最为广泛[11，12]。本研究所使用的LED 多波段光谱治疗仪具有IR、RL 及UV三种光源，研究表明[13，14]，IR 与RL 能够提升伤口温度、减轻疼痛、促进伤口愈合，UV 能够刺激新生组织的生长，提高局部血液循环和供氧，降低水肿，抑制细菌生长。通过比较各组大鼠创面愈合率可以看出，LEDT、IR、RL 及UV 组治疗第3 天后创面愈合率高于MC 组，治疗第14 天后愈合率更高，说明LED 多波段光谱治疗能够有效促进大鼠创面愈合。通过比较HE 染色结果可以看出，LED 多波段光谱治疗能够减轻大鼠创面早期的炎症反应，并且能够促进再上皮化的进程，从而加速创面的愈合。

EGF 作为一种内源性保护物质，具有提高细胞再生能力，加快表皮生长的作用[15]。TGF-β1是促进细胞分裂、增殖和趋化的重要的生长因子，并且有研究发现[16]，TGF-β1能够加速愈合初期上皮细胞的增殖。VEGF 是促进血管内皮细胞有丝分裂的细胞因子，具有促进血管内皮细胞增殖的作用，是促进血管生成的直接相关因子[17]。此外，本研究结果发现，LEDT 组、IR 组、RL 组 和UV 组 治 疗 第14 天 后EGF、VEGF、TGF-β1表达量均高于MC 组（P＜0.01），但LEDT 与IR 组TGF-β1比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示LED 多波段光谱治疗能够有效促进大鼠创面中相关蛋白的表达，对创面愈合起到有效的促进作用。

综上所述，LED 多波段光谱治疗能够有效提高大鼠创面各个阶段的愈合率，促进皮肤再上皮化进程，提高创面中EGF、TGF-β1及VEGF 蛋白表达水平。