黄 成，周仁杰，黄保生,，韩燕全，朋汤义，金传山，吴德玲

（1.安徽中医药大学第一附属医院/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学/中药复方安徽省重点实验室/现代药物制剂安徽省工程技术中心，安徽 合肥 230031）

苍耳子为菊科植物苍耳（Xanthium sibirium Patr.）的干燥成熟带总苞果实，为治疗鼻渊头痛之要药[1]，至今已有1 800多年药用历史。苍耳子药材资源丰富，临床应用广泛[2-3]。现代研究表明，苍耳子具有抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗肿瘤等药理作用[4-6]。2020年版《中华人民共和国药典》一部记载苍耳子“味辛、苦，性温，有毒，归肺经”，须炒制去刺后使用[7]。文献研究表明，苍耳子对机体毒性影响最主要的部位是肝脏[8-9]。CYP450酶是肝脏中非常重要的Ⅰ相药物代谢酶，其亚型CYP1A2和CYP3A4分别代谢40%～50%的临床药物，在药物代谢中起到关键作用[10-12]，目前尚未见基于CYP450酶活性探讨苍耳子炮制减毒机理的研究。

本实验通过构建小鼠肝微粒体孵育体系，以咖啡因和咪达唑仑分别作为CYP1A2、CYP3A4两种酶的探针药物，用HPLC检测其消耗量，计算酶的相对活性，并结合血清生化指标检测及病理切片观察来确定肝损伤的程度，从而研究苍耳子的炮制对此两种CYP酶活性的影响，以及与肝损伤程度间的关系，以期为苍耳子的炮制减毒机理研究及临床安全用药提供依据，同时为其他毒性药材的研究提供思路。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF级昆明种雄性小鼠49只，体质量（20.0±2.0）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。动物于12 h光照或黑夜循环环境中饲养，保持温度为（23±2）℃，相对湿度为（50±5）%，自由摄水摄食，适应性饲养4 d后开始实验。实验过程符合动物实验伦理规范要求。

1.2 仪器与试剂 Nexera XR LC-20AD XR型高效液相色谱仪，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、SPD检测器和LabSolutions色谱工作站（日本SHIMADZU公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；3XZ21K型高速冷冻离心机（上海名元实业有限公司）。

苍耳子生品（批号：1911160062，产地：山东）购自亳州市沪谯药业有限公司，经安徽中医药大学谢冬梅副教授鉴定为菊科植物苍耳的干燥成熟带总苞果实；咖啡因对照品（批号：DST200510-001）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（批号：DST200712-090）购自成都德思特生物技术有限公司；咪达唑仑注射液（批号：MD200304）购自江苏恩华药业股份有限公司；地西泮注射液（批号：1902551）购自天津金耀药业有限公司；甲醇、乙腈均为色谱级，购自SIGMA公司；蒸馏水购自屈臣氏公司。

苍耳子炮制品制备：取洁净的河砂置锅内，武火加热至滑利状态，测定离锅底1 cm左右处的温度，待温度稳定至160 ℃时，投入苍耳子炒制7 min，炒至表面微黄出锅，放凉备用[13]。

2 方 法

2.1 苍耳子水煎液制备 取苍耳子生品、炮制品各150 g分别加10倍量的水浸泡30 min，武火煮沸后，文火继续煎煮30 min，过滤后留存，药渣加入8倍量水进行二次煎煮并过滤，合并滤液后浓缩至质量浓度为2 g/mL。

2.2 动物分组及给药方法 将49只昆明小鼠按照体质量随机分成正常组、苍耳子生品低剂量组、苍耳子生品中剂量组、苍耳子生品高剂量组、苍耳子炮制品低剂量组、苍耳子炮制品中剂量组、苍耳子炮制品高剂量组，每组7只。苍耳子人用量为10.0 g/d，按照人与小鼠体质量进行剂量换算，苍耳子生品和炮制品低剂量组（13.0 g/kg）、苍耳子生品和炮制品中剂量组（26.0 g/kg）和苍耳子生品和炮制品高剂量组（39.0 g/kg），分别相当于临床人用剂量的10、20和30倍[14]。各给药组小鼠按照0.2 mL/10 g体积灌胃生、炒苍耳子水煎煮液，正常组小鼠灌胃等体积的生理盐水，1次/d，连续10 d。实验期间小鼠自由饮食。

2.3 溶液配制

2.3.1 Cooktail药物探针 精密称取10.600 mg咖啡因对照品，加入适量甲醇配制成浓度为9.0 mmol/L的咖啡因母液，按相同方法配制浓度为1.5 mmol/L的咪达唑仑母液，取两种母液适量混合后配制成咖啡因浓度为15.0 μmol/L、咪达唑仑浓度为2.5 μmol/L的Cooktail混合液。

2.3.2 标准曲线工作液 在灭活过的肝微粒体孵育体系中，加入咖啡因母液适量使其浓度分别为3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 μmol/L，加入咪达唑仑母液使其浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol/L。

2.3.3 TMS缓冲溶液 称取0.610 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、0.060 g MgCl2·6H2O、6.850 g蔗糖，混合后以超纯水溶解至100 mL，加盐酸调节pH值至7.4，4 ℃储存备用。

2.3.4 Tris-HCl溶液 将1 mol/L的Tris-HCl加入超纯水分别稀释成0.10、0.01 mol/L的Tris-HCl溶液。

2.3.5 NADPH溶液 精密称取3.080 mg NADPH，加入适量的纯水配制成50mmol/L的溶液，4 ℃储存备用。

2.3.6 含地西泮的反应终止液 取地西泮注射液（2 mg/mL）1 mL，加入适量甲醇配制成8 μg/mL的溶液，4 ℃储存备用[15]。

2.4 小鼠肝微粒体制备 第10天灌胃后禁食24 h，腹腔注射20%乌拉坦溶液麻醉，眼球取血，迅速打开腹腔取出肝脏，颈椎脱臼处死小鼠。用滤纸吸干肝脏表面血液，将肝脏置于下垫冰盒的表面皿中，用剪刀剪开后分别装入EP管中，称取1.5 g肝组织加入4倍量的TMS溶液，剪碎，匀浆机搅拌制备匀浆，放入高速冷冻离心机，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液加入0.1 mL的68 mmol/L CaCl2溶液进行沉淀，4 ℃、20 000 r/min离心20 min，取沉淀物加0.1 mol/L的Tris-HCl 1 mL，涡旋1 min混匀，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，得到的粉色沉淀即为肝微粒体，将其重新悬于1 mL的0.01 mol/L Tris-HCl中，-80 ℃冰箱保存备用[16]。用BCA蛋白质量试剂盒测肝微粒体蛋白的浓度。

2.5 体外孵育 肝微粒体孵育体系总体积为500 μL，取肝微粒体悬液10 μL按照表1的步骤依次加入探针药物和缓冲液，然后加入NADPH启动反应，于37 ℃恒温水浴中孵育30 min，最后加入预冷的地西泮终止液500 μL，12 000 r/min离心15 min，取上清液10 μL进样分析。

表1 肝微粒体孵育体系加样顺序

2.6 色谱条件 色谱柱为岛津Shim-pack GISP-HPLC18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱程序如表2所示，流速：0.4 mL/min；检测波长：254 nm；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃。

表2 HPLC 测定Cooktail 探针药物及内标物的洗脱条件

2.7 观察指标

2.7.1 血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）活性 取材后按照试剂盒说明书，用ELISA法检测血清AST、ALT的活性。

2.7.2 肝脏组织病理学变化 将肝脏组织移至4%多聚甲醛溶液中，在固定24 h后，进行脱水和石蜡包埋，制成石蜡切片，随后进行HE染色，在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

2.7.3 CYP1A2、CYP3A4酶相对活性 通过测定样品组探针药物咖啡因和咪达唑仑的峰面积，将其与内标物地西泮的比值代入到标准曲线中，计算出两种探针药物在肝微粒体体系中的浓度，正常组的探针药物浓度为总底物浓度，给药组浓度为剩余浓度。CYP1A2和CYP3A4两种酶的相对活性计算公式：酶相对活性=（总底物浓度-剩余浓度）/总底物浓度×100%。

2.8 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，计量资料符合正态分布且方差齐，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 方法学验证

3.1.1 线性关系考察 将两种药物的标准曲线工作液按“2.6”项方法进样，以反应物浓度为横坐标（X），反应物与底物的峰面积比值为纵坐标（Y）分别绘制标准曲线，得到回归方程。咖啡因：Y=0.018 4X-0.000 7，r=0.999 9。咪达唑仑：Y=0.054 6X-0.000 3，r=0.999 8。表明在3～30 μmol/L和0.5～5 μmol/L内线性关系良好。

3.1.2 专属性试验 空白肝微粒体+内标物、探针药物+内标物、孵育过的肝微粒体样品（苍耳子炮制品中剂量组3号）+内标物的HPLC色谱图见图1。在本实验条件下，各药物分离完全，无杂质峰干扰，咖啡因、咪达唑仑和地西泮的保留时间分别是4.298、8.988、9.557 min，专属性良好。

3.1.3 精密度试验 取10 μL小鼠肝微粒体，加入PBS缓冲液460 μL，60 ℃加热使肝微粒体失活，冷却至室温，加入Cooktail探针药物10 μL和NADPH 20 μL，按“2.6”项方法进样，平行测量6次，计算日间精密度，测得咖啡因和咪达唑仑的RSD分别为0.45%和0.35%，符合试验要求。

3.1.4 稳定性试验 取苍耳子生品中剂量组4号样品孵育，然后按照“2.6”项方法在0、2、4、6、12、24 h时分别进样，结果咖啡因和咪达唑仑的RSD分别为0.63%和1.13%，说明样品在24 h内基本稳定。

3.1.5 重复性试验 取苍耳子生品中剂量组6号样品进行孵育，按照“2.6”项方法连续进样6次，咖啡因和咪达唑仑的RSD分别为0.55%和0.75%，符合试验要求。

3.1.6 加样回收率试验 取不同的已知浓度样品100 μL，加入探针药物混合液100 μL，共制作6组，按照“2.6”项方法进样，咖啡因和咪达唑仑的平均加样回收率分别是102.6%和101.37%，RSD分别是1.60%和1.97%。（见表3）

表3 肝微粒体样品中咖啡因和咪达唑仑加样回收率试验结果（n=6）

3.2 各组小鼠血清AST、ALT活性比较 苍耳子生品中、高剂量组和苍耳子炮制品高剂量组小鼠血清AST、ALT活性均高于正常组（P＜0.05或P＜0.01）；苍耳子生品低剂量组、苍耳子炮制品中剂量组小鼠血清ALT活性均高于正常组（P＜0.05）；同等剂量下，苍耳子生品低、中、高剂量组小鼠血清AST、ALT活性均分别高于苍耳子炮制品低、中、高剂量组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明苍耳子生品和炮制品均能造成小鼠肝损伤，炮制品造成的肝损伤较轻。

表4 各组小鼠血清AST、ALT 活性比较（，U/L）

表4 各组小鼠血清AST、ALT 活性比较（，U/L）

注：与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

3.3 各组小鼠肝组织病理变化情况 正常组小鼠肝脏细胞围绕中央静脉呈规则的放射状排列，大小均匀，排列紧密，细胞核饱满，结构形态正常；苍耳子生品的低、中剂量组小鼠肝脏细胞出现细胞核萎缩现象，苍耳子生品高剂量组小鼠肝脏细胞出现细胞核萎缩及四周空洞现象；苍耳子炮制品低剂量组小鼠肝脏细胞形态基本正常，苍耳子炮制品中、高剂量组小鼠肝脏细胞出现不同程度的细胞核萎缩及四周空洞现象。（见图2）

3.4 各组小鼠肝脏微粒体中CYP1A2、CYP3A4活性比较 苍耳子生品中、高剂量组和苍耳子炮制品的中、高剂量组小鼠肝脏微粒体中CYP1A2活性均明显高于正常组（P＜0.05或P＜0.01）；苍耳子生品高剂量组和苍耳子炮制品高剂量组小鼠肝脏微粒体中CYP3A4活性均明显高于正常组（P＜0.05）；同等剂量下，苍耳子生品低、中、高剂量组小鼠肝脏微粒体中CYP1A2、CYP3A4活性均分别高于苍耳子炮制品低、中、高剂量组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明苍耳子能诱导这两种酶的活性，并且炮制后能减轻对这两种酶的诱导作用。

表5 各组小鼠肝脏微粒体中CYP1A2、CYP3A4相对活性比较（）

表5 各组小鼠肝脏微粒体中CYP1A2、CYP3A4相对活性比较（）

注：与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

4 讨 论

苍耳子在临床上有着广泛的应用，常用于治疗风寒感冒、慢性鼻炎、过敏性鼻炎、皮肤病及风湿性关节炎等疾病[17]。苍耳子生品有小毒，由于未经炮制或者炮制不当导致的中毒事件时有发生。其毒性主要表现为对机体脏器的损害，其中对肝脏的损害尤为严重[18]。目前关于苍耳子炮制减毒机理的研究主要集中在炮制前后毒、效成分的变化及对药效的影响方面[19]，其具体的毒性机制需要进一步研究探讨。肝脏是药物代谢的主要器官，肝脏中CYP1A2、CYP3A4酶是较重要的两种CYP450亚酶，从对肝药代谢酶活性影响的角度进行研究有望从新视角探明苍耳子的炮制减毒机理[20-21]。

本实验建立了小鼠肝微粒体孵育体系，通过HPLC检测CYP1A2、CYP3A4酶的特异性代谢物咖啡因、咪达唑仑在孵育过程中的消耗量来观察不同给药组酶的相对活性变化。本研究发现苍耳子生品低、中、高剂量组和苍耳子炮制品低、中、高剂量组对CYP1A2酶的诱导作用均高于正常组，且同剂量比较时，苍耳子生品低、中、高剂量组对CYP3A4酶的诱导作用分别高于苍耳子炮制品低、中、高剂量组；结合血清AST、ALT的检测和肝脏HE染色病理切片观察，本研究发现苍耳子生品低、中、高剂量组的肝脏损伤情况分别较苍耳子炮制品低、中、高剂量组更为严重，肝损伤严重程度和酶活性升高的趋势基本一致。本实验结果表明，相同剂量的苍耳子生品对CYP1A2、CYP3A4酶的诱导作用高于苍耳子炮制品，苍耳子炮制后对CYP1A2、CYP3A4酶活性的诱导作用减弱，可能是苍耳子炮制减毒的机理之一。由于CYP450酶族系众多，其活性同时受到环境、遗传、饮食、情绪等因素的影响,苍耳子炮制后对其他CYP450酶的诱导效果如何，还需要进一步研究。