郭泽乐，何丽清，储开博，尹炼

（山西中医药大学，山西 晋中 030619）

肺阳虚证是指肺脏阳气不足，温煦失职引起机体功能衰退及一系列临床表现的概称，多见于外感及其他内伤杂病后期[1]。究其成因，多责之于外感寒邪，内伤生冷或久居阴寒之地。以往研究表明[2]，肺阳虚证会使机体免疫能力下降，增加机体感染的风险。目前西医多采用抗炎抗病毒联合抗生素进行治疗[3]，但该治疗手段所采用药物多属寒凉之品，在治疗的同时也可能造成严重的副作用，不仅肺脏本体受损，更牵连到其他脏器，加重对机体的损害。中医药在治疗肺阳虚证方面具有较好疗效，在提高机体免疫力的同时能预防其他感染，能够安全、高效地治疗呼吸系统疾病[4]。柴胡桂枝汤是《伤寒论》中的经典名方，具有外散风寒、通调三焦气机之功效。方中桂枝、生姜清太阳表寒，柴胡、黄芩通畅气机，人参、炙甘草、大枣益气健脾。肺为娇脏，不耐寒燥，因此在选方治疗方面，应着重考虑肺的功能属性。柴桂沙麦汤是在柴胡桂枝汤的基础上加沙参、麦冬而成，全方温散但不伤正气，升阳但无燥热之弊。前期临床观察发现该方治疗肺阳虚疾病具有很好的疗效[5]，但是目前对于柴桂沙麦汤的免疫作用机制未深入了解。因此，本实验拟探讨柴桂沙麦汤对肺阳虚小鼠血清炎症细胞因子和T淋巴细胞亚群水平的影响，研究柴桂沙麦汤可能的免疫作用机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级Bal b/c小鼠60只，雌雄各半，体质量18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。本实验小鼠饲养于山西中医药大学科研楼动物实验中心动物房，饲养条件为室内温度22～26 ℃，湿度40%～60%，自然光照，自由饮食，饲养条件符合《实验动物管理条件》要求，适应性喂养1周后开始实验。本实验研究方案获得山西中医药大学医学伦理委员会批准，批准编号：2020DW068。

1.2 药物与试剂 柴桂沙麦汤（方药组成：桂枝6 g，柴胡9 g，黄芩6 g，人参5 g，半夏6 g，白芍3 g，炙甘草3 g，大枣3 g，生姜3 g，麦冬5 g，沙参5 g）由山西中医药大学国医堂药房提供。APC Anti-mouse CD3 [17A2]（批号：20200311）、FITC Anti-mouse CD4[GK1.5]（批号：20201215)、PerCP-Cyanine5.5 Anti-mouse CD8a[53-6.7]（批号：20200607）均购自Tonbo Biosciences公司；小鼠白细胞介素-2（IL-2）ELISA检测试剂盒（批号：20210319）、小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒（批号：20210117）、小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（批号：20210216）均购自上海江莱生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 BSM120.4电子分析天平（上海卓精公司）；Infinite F50酶标分析仪（瑞士帝肯公司）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；HW-1500A切片机（德国LEICA公司）；DHG干燥箱（上海一恒公司）；TG16-W离心机（湖南湘仪公司）。

1.4 造模与分组 60只Bal b/c小鼠适应性喂养1周后，采用完全随机分组法分为空白组、模型组、柴桂沙麦汤低剂量组、柴桂沙麦汤中剂量组、柴桂沙麦汤高剂量组，每组12只。除空白组外，其余各组复制肺阳虚小鼠模型[6]。提前用冰块制造0～4 ℃低温环境，小鼠每日在此环境中冰冻1 h，结束后对小鼠实施冰水力竭游泳，此过程持续30 d。造模期间各组小鼠给予8%低蛋白饲料喂养，除空白组以外，其他各组小鼠给予冰水灌胃，2次/d，0.2 mL/次。若小鼠出现体质量下降、行动迟缓、拱背、反应力下降、爱扎堆、食欲不振并伴随咳嗽、打喷嚏等情况，说明造模成功。

1.5 实验给药 柴桂沙麦汤低、中、高剂量组给药浓度按照《药理实验方法学》[7]中人和动物间体表面积折算的等效剂量比计算，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组的药物剂量分别为2.7、5.4、10.8 g/（kg·d）。造模成功后，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给予不同剂量的柴桂沙麦汤。空白组和模型组小鼠给予等体积生理盐水[6]，1次/d，连续30 d。

1.6 观察指标

1.6.1 小鼠体质量、脾脏指数和胸腺指数[8]分别于第1、15、30天给药前（禁食不禁水）测量小鼠体质量；第31天脱颈椎处死小鼠，用75%酒精对小鼠表皮进行消毒处理，在无菌环境下取出小鼠脾脏和胸腺，用生理盐水冲洗器官表面残血并用滤纸清理器官表面多余的水分，称取器官湿质量，并按照公式分别计算脾脏指数和胸腺指数。脾脏（胸腺）指数=脾脏（胸腺）质量/体质量×10。

1.6.2 小鼠外周血清IL-2、IL-6和TNF-α水平 小鼠行眼球采血，室温条件下静置4 h，以4 000 r/min离心20 min，取上层血清，并按照ELISA试剂盒说明书进行操作，上机检测血清IL-2、IL-6和TNF-α水平。

1.6.3 小鼠脾脏T淋巴细胞亚群 无菌条件取出脾脏，用PBS冲洗表面血污，将小鼠脾脏移入培养皿中，用5 mL注射器针栓研磨，200目过滤网过滤，制成脾脏淋巴细胞悬液，定容至5 mL，混匀收集。在1 000 r/min的条件下离心8 min，弃上清液，加入红细胞裂解液，室温条件下静置5 min后，以1 000 r/min的条件离心8 min，弃上清液，加入5 mL PBS重悬混匀，同等条件下离心8 min，弃上清液，调整细胞浓度并用PBS清洗后定容至100μL，同时加入CD3、CD4、CD8三种抗体各1μL，避光染色20 min后加入500 μL PBS终止反应，以1 000 r/min的条件离心8 min，弃上清液，之后再加入500 μL PBS，以相同的条件离心后弃上清液，PBS定容至500 μL混匀上机检测。实验中所有样本均制备阴性样本。

1.6.4 小鼠肺组织形态学观察 处死小鼠后，在无菌环境下取出小鼠肺组织，用生理盐水冲洗表面血污，用滤纸擦干表面水分，在4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋并切片，HE染色后镜下观察。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行分析。计量资料以“均数±标准差”（）表示，首先对数据进行正态性检验和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，重复测量数据采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠体质量比较 由于造模影响，各组小鼠体质量整体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），存在分组效应，与空白组比较，模型组和柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠体质量均明显降低（P＜0.05）。给药第15、30天，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠体质量均明显高于模型组（P＜0.05）。所有小鼠不同时间点体质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应，空白组和柴桂沙麦汤低、中、高剂量组均如此，存在时间效应；时间因素与组别因素存在交互效应，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见表1、图1）

表1 各组小鼠体质量比较（）

表1 各组小鼠体质量比较（）

注：F时间主效应=100.476，P时间主效应=0.000；F分组主效应=85.889，P分组主效应=0.000；F交互效应=15.204，P交互效应=0.000；与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

2.2 各组小鼠脾脏指数、胸腺指数比较 与空白组比较，模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠脾脏指数和胸腺指数均明显升高（P＜0.05）；柴桂沙麦汤低、中、高剂量组间小鼠脾脏指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；柴桂沙麦汤高剂量组小鼠胸腺指数高于柴桂沙麦汤低剂量组（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠脾脏指数、胸腺指数比较（）

表2 各组小鼠脾脏指数、胸腺指数比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柴桂沙麦汤低剂量组比较，cP＜0.05

2.3 各组小鼠外周血清IL-2、IL-6和TNF-α水平含量比较 与空白组比较，模型组小鼠血清IL-2水平明显降低（P＜0.05），IL-6、TNF-α水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠血清IL-2水平明显升高（P＜0.05），IL-6、TNF-α水平均明显降低（P＜0.05），且柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠血清IL-2和IL-6水平呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（P＜0.05）；柴桂沙麦汤中剂量组小鼠血清TNF-α水平低于柴桂沙麦汤低剂量组（P＜0.05）；柴桂沙麦汤高剂量组小鼠血清TNF-α水平与柴桂沙麦汤中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组小鼠外周血清IL-2、IL-6、TNF-α 水平比较（）

表3 各组小鼠外周血清IL-2、IL-6、TNF-α 水平比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柴桂沙麦汤低剂量组比较，cP＜0.05；与柴桂沙麦汤中剂量组比较，dP＜0.05

2.4 各组小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值比较 与空白组比较，模型组小鼠CD3+T淋巴细胞百分比明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠CD3+T淋巴细胞百分比均明显升高（P＜0.05），其中以柴桂沙麦汤高剂量组升高最为明显，柴桂沙麦汤低、中剂量组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4、图2）

与空白组比较，模型组小鼠CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值均明显降低（P＜0.05），CD8+T淋巴细胞百分比明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，柴桂沙麦汤中、高剂量组小鼠CD4+T淋巴细胞百分比明显升高（P＜0.05），CD8+T淋巴细胞百分比明显降低（P＜0.05），CD4+/CD8+比值明显升高（P＜0.05），其中以柴桂沙麦汤高剂量组最为明显。柴桂沙麦汤低剂量组小鼠CD4+T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表4、图3）

表4 各组小鼠脾脏CD3+T 淋巴细胞百分比比较（）

表4 各组小鼠脾脏CD3+T 淋巴细胞百分比比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柴桂沙麦汤低剂量组比较，cP＜0.05；与柴桂沙麦汤中剂量组比较，dP＜0.05

表5 各组小鼠脾脏CD4+、CD8+T 淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值比较（）

表5 各组小鼠脾脏CD4+、CD8+T 淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值比较（）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柴桂沙麦汤低剂量组比较，cP＜0.05；与柴桂沙麦汤中剂量组比较，dP＜0.05

2.5 各组小鼠肺组织病理形态比较 空白组小鼠肺组织无明显异样，肺泡及终末支气管上皮细胞结构完整排列整齐，无明显炎症细胞浸润。模型组小鼠肺泡出现明显炎症细胞浸润，肺泡组织结构破坏，间隔缩小。柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠肺组织结构明显好转；柴桂沙麦汤低剂量组小鼠肺泡腔塌陷好转，腔隙内炎症细胞浸润减少。柴桂沙麦汤中剂量组小鼠肺泡腔进一步好转，腔内间隙明显增宽；柴桂沙麦汤高剂量组小鼠肺组织改善最为明显，但未恢复至空白组水平。（见图4）

3 讨 论

肺阳虚证先贤多有论述，从《难经·四十九难》中提到的“形寒饮冷则伤肺”和《黄帝内经》中提到的“重寒伤肺”及《金匮要略》中记载的“肺中冷”可以看出，本证成因系外伤风寒，肺先受病，内伤饮冷，脾阳不振，母病及子，致内外皆伤[9]。因此，本实验以此为理论基础，并且根据相关经验[10-11]采用每日冰冻1 h模拟外邪犯肺，每日冰水力竭游泳模拟形寒劳倦，每日冰水灌胃以及低蛋白饮食模拟内饮生冷，阳气不振，采用多种因素方法复制肺阳虚小鼠模型。结果显示，小鼠行动能力变差，喜扎堆，钻于垫料中，大便稀软，体质量明显降低，表明小鼠肺阳虚模型复制成功。外感寒邪，肺卫失固，因此出现恶寒等阳虚的表现；肺受寒则气化不行，水液不布，脾阳不振，故大便溏。灌胃柴桂沙麦汤后，小鼠体质量逐渐恢复，精神状态好转，咳嗽、打喷嚏次数减少，行动能力改善，大便性状改善。说明柴桂沙麦汤能改善小鼠肺阳虚症状。

相关研究表明，阳虚证候会引起机体免疫功能减退[12]。本实验中模型组小鼠脾脏CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值明显降低，CD8+T淋巴细胞百分比水平升高，IL-2细胞因子降低，这表明肺阳虚证会使机体免疫能力减退。柴胡桂枝汤由小柴胡汤、桂枝汤二方合成。根据相关报道[13-14]，临床上依据肺阳虚患者外感风寒，营卫失和，内伤饮冷，伤正日久，邪气内陷，阳气亏虚的病机，选用柴胡桂枝汤治疗肺阳虚患者具有较好疗效。方中桂枝汤可以外散风寒，调和营卫，而小柴胡汤主要和解半表半里之邪，固护正气，待大气一转，则机体阳气升发，温煦功能自然恢复。中国北方地区冬季多寒冷而干燥，饮食习惯多为膏粱厚味，容易形成虚实夹杂、寒热错杂之证，因此，本课题组将柴胡桂枝汤化裁，加入沙参和麦冬，改良成为柴桂沙麦汤[5]。柴桂沙麦汤以桂枝为君药，发表散寒，辛温通阳；人参、生姜、半夏为臣药，益气健脾，温肺化痰，同时可助桂枝祛邪透表；方以柴胡、黄芩为佐药，两药相合调理三焦气机，肺胃得安；然肺为娇脏，肺阳虚一证中以正气亏虚为主，但若纯用辛温发散之品，恐温燥伤肺，暗耗阴津，因而勤求古训，“善补阳者，阴中求阳”，故于本方中加入甘凉清润之沙参、麦冬与白芍，以上润肺体，下滋肾阴。另以炙甘草为使，益气和胃，配伍桂枝、生姜辛温化阳，助解表散寒，配伍白芍、沙参和麦冬，以酸甘坚阴，同时可以制约桂枝、半夏之温燥。全方配伍得当，调畅营卫与三焦，同时散寒升阳但无温燥之弊，可做到标本兼顾。

现代医学认为，脾脏和胸腺是重要的免疫器官，是衡量机体免疫能力的重要指标[15]。本实验结果显示，模型组小鼠脾脏、胸腺指数明显低于空白组，可能由于外寒内饮的刺激，导致模型组小鼠免疫器官指数下降。柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠免疫器官指数明显高于模型组，可能为方中人参、炙甘草等药联合作用的结果。同时，柴桂沙麦汤可以增加肺阳虚小鼠的体质量。MOSMANN T R等[16]将Th细胞分为Th1和Th2两种功能不同的细胞因子亚群，IL-2、TNF-α主要由Th1细胞分泌，参与细胞免疫。IL-6主要由Th2细胞分泌，参与体液免疫。IL-2可促进淋巴细胞增殖、分化、生长，诱导免疫细胞分泌细胞因子发挥免疫效应，对机体抗病毒感染和增强免疫应答有重要作用，因此，IL-2水平是反映机体细胞免疫的重要标志。IL-6是一种作用广泛的细胞因子，具有抗感染、调节免疫应答的作用，当单核巨噬细胞受到病毒的刺激时会产生大量的IL-6。同时，IL-6是机体炎症反应最先出现的细胞因子，对于判断急性炎症具有重要作用。TNF-α主要是由单核巨噬细胞产生的内源性细胞因子。研究表明，少量的TNF-α具有抗炎属性，可抑制机体炎症反应和杀灭癌细胞，但是大量的TNF-α则变成促炎因子，会促进T细胞产生各种炎症因子，进而诱发炎症反应，引起机体器官组织的坏死[17-19]。IL-2可以反映机体免疫功能，IL-6和TNF-α都属于促炎因子。当肺阳虚患者机体免疫能力降低时，易诱发炎症反应，因此检测炎症细胞因子的表达，对于疾病的诊疗有着至关重要的作用。本研究发现，柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠血清IL-2水平明显高于模型组，IL-6、TNF-α水平明显低于模型组，并且以柴桂沙麦汤中、高剂量组更为显著，由此可以说明柴桂沙麦汤具有调节机体血清细胞因子、抑制炎症反应、提高细胞免疫的作用。T淋巴细胞亚群主要用于监测机体细胞免疫功能。其中CD3+T淋巴细胞作用于成熟细胞表面，参与机体抗原应激反应。CD4+T淋巴细胞主要发挥免疫调节作用，可抑制免疫细胞的活化，从而避免机体发生免疫性疾病。CD8+T淋巴细胞是一种细胞毒性的T淋巴细胞，具有抗感染功能，可以杀灭被感染的靶细胞[20-21]，同时，CD4+/CD8+比值也可反映机体当前的免疫状态。本研究发现，与空白组比较，模型组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比明显降低，CD8+T淋巴细胞百分比明显升高，说明肺阳虚小鼠免疫功能下降；柴桂沙麦汤低、中、高剂量组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值均明显升高，CD8+T淋巴细胞百分比降低，并且以柴桂沙麦汤高剂量组效果更为明显。

综上所述，柴桂沙麦汤具有缓解肺阳虚小鼠症状的功效，能提高肺阳虚小鼠脾脏指数、胸腺指数及体质量，升高血清IL-2水平，降低血清IL-6、TNF-α水平，改善肺部形态结构，其作用机制可能与调节T淋巴细胞亚群的平衡，增强机体细胞免疫有关。