邱琼华，覃子龙，张 蓓，韦 倩，李隽永，梁学政

（1.柳州市中医医院/柳州市壮医医院，广西 柳州 545001；2.柳州市质量检验检测研究中心，广西 柳州 545001）

清热颗粒为柳州市中医医院的医院制剂，已申报注册二十多年，处方由岗梅、野菊花、千里光、紫花地丁、桑叶、蒲公英6味药物组成。清热颗粒具有清热解毒、清肝明目、疏风散热的作用，临床上常用于呼吸系统疾病、皮肤疮痈肿毒等，效果显著，使用量较大。但由于该制剂申报时间较早，质量标准不完善，缺乏含量控制指标，尚不能全面反映制剂质量。

为对清热颗粒进行更全面的质量评价，本研究采用一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）对清热颗粒中的5种有效成分进行含量测定。QAMS是近年来广泛用于中药质量评价的一种方法，它利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，只测定1个成分即可实现多个成分同步测定的方法，具有经济、便捷的优点[1-2]。本研究以绿原酸为内参物，建立绿原酸与隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷等有效成分的相对校正因子，同时测定5种成分的含量，实现对清热颗粒质量较为全面的控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-20AT高效液相色谱仪，配备SPD-M20A检测器（日本岛津公司）；UV-2450二极管阵列检测器（日本岛津公司）；Waters e2695型高效液相色谱仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；XS205DU型分析天平（梅特勒-托利多公司）；AE200型分析天平（梅特勒-托利多公司）；GWB-2E型超纯水机（北京普析通用仪器有限责任公司）；SK8200HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药绿原酸（批号：MUST-20032310，含量：99.73%）、隐绿原酸（批号：MUST-20042403，含量：99.07%）、秦皮乙素（批号：MUST-20070504，含量：99.87%）、蒙花苷（批号：MUST-20031612，含量：98.65%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司。木犀草苷（批号：111720-201406，含量：94.9%）购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇均为色谱纯，购自弗顿科学技术有限公司。清热颗粒5批（批号：20190905，20200102，20200501，20200504，20201101）购自柳州市中医医院。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷对照品适量，以70%甲醇溶解并定容，用0.45 μm滤膜滤过，即得混合对照溶液[绿原酸（50.66 μg/mL）、隐绿原酸（52.61 μg/mL）、秦皮乙素（51.83μg/mL）、木犀草苷（15.69 μg/mL）、蒙花苷（14.86 μg/mL）]。

2.1.2 供试品溶液的制备 取质量差异下的清热颗粒10袋，混匀，取约10.0 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入70%的甲醇50 mL，超声30 min，取出，放冷，定容，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按清热颗粒的处方及制法，制备缺野菊花、缺紫花地丁阴性对照品，按“2.2.2”项下方法操作，制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件Welchrom C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，10%乙腈；5～20 min，10%→20%乙腈；20～30 min，20%乙腈；30～55 min，20%→45%乙腈；55～60 min，45%乙腈；60～65 min，45%→10%乙腈；65～70 min，10%乙腈；体积流量为1 mL/min；测定波长为320 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。

2.3 系统适应性及专属性试验分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，进样分析，结果见图1。绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰计算均在10 000以上。缺紫花地丁和缺野菊花的阴性对照品在相应位置处未见色谱峰，表明方法专属性良好。

图1 HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液，制成6个不同质量浓度的对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定。记录相应的色谱峰峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），进行线性回归。结果见表1。

2.4.2 检测限与定量限 取“2.1.1”项下混合对照品溶液逐步稀释，以信噪比S/N=3/1测定检测限，以S/N=10/1测定定量限，结果见表1。

表1 5种成分的线性关系考察结果

2.4.3 精密度试验 称取样品（批号：20200102）粉末约10 g，精密称定，制备供试品溶液，连续进样6次，记录各色谱峰峰面积，计算绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷峰面积的RSD值分别为0.19%、0.17%、0.12%、0.16%、0.11%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 称取样品（批号：20200102）粉末约10 g，精密称定，制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱峰，计算绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷峰面积的RSD值分别为0.13%、0.12%、0.14%、0.51%、0.16%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 称取样品（批号：20200102）粉末约10 g，共6份，精密称定，分别制备供试品溶液，进样测定，计算绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷质量分数的RSD值分别为0.16%、0.27%、0.19%、0.34%、0.26%，结果表明本试验的重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取样品（批号：2020102）粉末6份，精密称定，每份5 g，分别置锥形瓶中，加入中等浓度的对照品储备溶液适量（相当于样品中各成分的50%），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，计算加样回收率，结果表明本试验方法回收率良好。（见表2）

表2 加样回收率试验结果

附表2：

2.5 相对校正因子（fk/s）的计算[3-6]

2.5.1 多点校正法 以多个质量浓度点计算所得的fk/s取平均值作为定量用fk/s。其中fk/s=（Cs×Ak）/（Ck×As）；待测成分质量浓度Ck′=（Cs×Ak′）/（fk/s×As）。两式中Cs为参照物质质量浓度，As为参照物质色谱峰峰面积，Ck为其他对照组分质量浓度，Ak为其他对照组分色谱峰峰面积，Ak′为待测组分色谱峰峰面积。以绿原酸为内参物，应用以上多点校正法进行计算，得到其他成分相对于绿原酸的fk/s。由表3可知，隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的fk/s分别为1.050 7、1.223 1、1.508 7、1.437 4，RSD值分别为0.51%、0.25%、0.29%、0.20%。（见表3）

表3 以绿原酸为参照的fk/s（多点校正法）

2.5.2 斜率校正法 用“2.4.1”项下所得的各成分标准曲线计算X与Y的斜率之比即fk/s（fk/s=ak/as）。Ck′=Ak′/(as×fk/s)，as为参照物斜率，ak为其他对照组分斜率。应用斜率校正法进行计算，得到其他成分相对于绿原酸的fk/s。隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷对于绿原酸的fk/s分别为1.046 9、1.219 1、1.505 1、1.439 4。

2.5.3 定量因子 在公式Ck′=Ak′/(as×fk/s)中，当在同一实验室、同一仪器、同一色谱条件时，特别是在药厂或药检所大量样品短期内复检时，由于as基本一致，fk/s也是固定值，故可先以公式ak=asfk/s推算出定量因子ak，直接以待测样品峰面积Ak′即可快速推测其量（Ck′=Ak′/ak）。可见标准曲线中各成分的斜率值实际上就是其定量因子。应用此法需首先获得as值，并保证as值恒定。定量因子ak仅对同一仪器在相同色谱条件下短期内保持恒定，不同仪器应分别建立。另外定量因子计算所用fk/s为斜率校正法所得，故其计算结果与斜率校正法一致。结果绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的定量因子分别为27 555 502.04、26 332 161.83、22 602 724.56、18 307 697.59、19 143 636.44。

2.6 fk/s的重现性考察本试验考察了2套不同的色谱系统（LC-20AT、Waters e2695）及不同的色谱柱（Welchrom C18、UltimateAQ C18、Shin-pack GIST C18）对fk/s的影响。结果表明，各种条件下所得到的RSD值＜3.0%，本试验条件下不同仪器及色谱柱对各成分fk/s无显著影响。（见表4）

表4 不同仪器和不同色谱柱对fk/s的影响

2.7 待测组分色谱峰的定位利用相对保留时间进行定位，即以各待测组分色谱峰与绿原酸色谱峰的相对保留时间来确定。以绿原酸为基准峰，计算不同仪器和不同色谱柱下隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷相对保留时间。结果显示各种条件下所得到的RSD＜5.0%，表明本方法利用绿原酸来定位不同成分色谱峰是可行的。（见表5）

表5 不同仪器和不同色谱柱下的各色谱峰相对保留时间

2.8 一测多评法与常规法测定结果的比较取5批清热颗粒样品，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的峰面积，分别用外标法和3种一测多评法计算其含量，对比不同方法计算清热颗粒指标成分含量的差异，结果显示RSD均＜2%。说明一测多评法应用于清热颗粒多指标成分测定具有良好的准确定性，可信度较高。（见表6）

表6 清热颗粒中5种成分不同方法定量测定结果（n=3）

3 讨 论

3.1 指标性成分的选择清热颗粒临床上常用于治疗咽喉肿痛、上呼吸道感染、皮肤疮痈肿毒、湿疹等。本课题组前期曾对岗梅[7-8]中的冬青苷B、香叶木素、东莨菪内酯，蒲公英[9]中菊苣酸、咖啡酸，千里光[10]中金丝桃苷等成分进行检测，但该色谱条件下未被检出，推测该颗粒制备工艺中使用了醇沉工艺，导致部分化学成分流失。清热颗粒组方中各味药物均有抗炎、抑菌、抗病毒等功效。其中，绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷为抑菌、抗病毒的有效成分[11-13]，在清热颗粒多味药物中均有存在。其次秦皮乙素、蒙花苷分别为紫花地丁与野菊花中的特征性成分[14]，也是抑菌、抗炎、祛痰的有效成分[15-17]，故本研究选择绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、秦皮乙素、蒙花苷等5个成分作为清热颗粒质量控制的指标性成分。

3.2 试验方法的考察为了尽可能充分提取出清热颗粒中的有效成分。本试验前期考察了不同提取溶剂（100%、70%、50%甲醇）对指标性成分的影响，发现70%甲醇提取较为充分，各指标性成分响应较高。在此基础上，本研究比较了超声提取和回流提取两种方式，发现两者的提取率差异无统计学意义。而超声提取的操作便捷，故确定供试品溶液制备方法为70%甲醇超声30 min。另外，在考察检测波长时，由于绿原酸、隐绿原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷等5个成分的最大吸收波长均在300～350 nm[18-19]，当检测波长为320 nm时，样品中5种待测成分色谱峰的分离良好、峰面积较大，故本研究选择320 nm为5种成分的检测波长。同时预试验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液流动相系统在梯度洗脱条件下的分离效果。结果显示，以甲醇-水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时，分离度较差，且各成分出峰时间较长，故本研究选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为该检测条件的流动相。

3.3 3种一测多评法的比较本试验考察了一测多评法fk/s的3种不同计算方式，其中多点校正法为近年来多数文献所用，但由于其使用不同浓度参比对照溶液的峰面积计算其余成分的fk/s值，当参比对照溶液浓度较低或较高时，仪器容易产生检测误差，导致fk/s也有一定偏差。采用标准曲线斜率之比计算fk/s，系统误差不容易对标准曲线斜率产生影响，准确度较高，且斜率法直接使用线性回归方程中的斜率进行计算，相对更简便。定量因子计算所用fk/s为斜率校正法所得，故其计算结果与斜率校正法一致，但由于不同仪器对同一成分检测有一定差异，故每台仪器需单独建立相应方法的定量因子，此方法在大量样品短期内复检时较为简便。

4 小 结

本试验比较了外标法和3种一测多评法测定清热颗粒指标成分的含量，3种一测多评法计算的结果与外标法无显著差异，说明一测多评法测定清热颗粒多指标成分与外标法具有良好的一致性，准确度较高，重现性较好，实际工作中可根据需要选择适合的一测多评方法。此外，由于绿原酸对照品便宜易得，检测成本较低，适用于医院制剂日常检验工作中。综上所述，一测多评法可用于清热颗粒的质量控制。