卢礼平 王 欢 熊 玲 杨 桃 潘 婷 唐靖雯 潘 梅*

1.贵州威门药业股份有限公司，贵州 贵阳 550018；2.四川大学华西公共卫生学院分析测试中心，四川 成都 610041

铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥茎。其味甘，性微寒，归胃、肾经。具有益胃生津、滋阴清热功效，用于热病津伤、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软[1]。主要含有多糖类、生物碱类、芪类、黄酮类、茐酮类、苯丙素类、甾体类等成分，其中铁皮石斛主要的特征成分为石斛多糖[2]。现代医学[3]证明铁皮石斛具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂等作用。铁皮石斛叶为加工铁皮石斛鲜条(枫斗)的副产品[4]，研究[5-6]发现，铁皮石斛叶在化学成分种类上与茎相似，仅各成分含量不同。2018年国家卫计委将铁皮石斛叶作为新食品原料终止审查，审查意见为“鉴于该产品具有地方传统食用习惯，建议按照《食品安全法》第29条管理，终止审查”[7]，即铁皮石斛叶可作为地方特色食品管理。本研究拟通过对铁皮石斛叶进行急性经口毒性试验、遗传毒性试验(细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳细胞染色体畸变试验)、90 d经口毒性试验和大鼠致畸试验，以评价铁皮石斛叶毒性和安全性，旨在为贵州省食品安全地方标准“铁皮石斛叶”的建立提供理论支撑。

1 材料与仪器

1.1 动物与细胞 SPF级SD大鼠(20只，雌雄各半)、SPF级健康性成熟的未交配SD雄鼠和雌鼠，均由成都达硕实验动物有限公司提供；SPF级昆明种小鼠(50只)、SPF级离乳SD大鼠(108只)，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供；鼠伤寒沙门氏菌TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102购于上海保录生物科技有限公司；中国仓鼠肺(CHL)细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2 药物与试剂 铁皮石斛叶(采自贵州省内铁皮石斛主产区，详见表1)；2,4,7-三硝基-9-芴酮(TNF，批号：218031298，AccuStandard)；辅酶II(批号：410F022，Solarbio)；叠氮化钠(NaN3，批号：MKBS2540V，Sigma-Aldrich)；丝裂霉素C(MMC，批号：LBP4042V，Sigma)；2-氨基芴(2-AF，批号：STBF2332V，Sigma-Aldrich)；MTT溶液(批号：20181210，Solarbio)；秋水仙素(批号：09754，Sigma)；1,8-二羟基蒽醌(Dan，批号：WXBC6772V，Sigma Aldrich)；环磷酰胺(CP，批号：17101825，江苏盛迪医药有限公司)；小牛血清(批号：20161021，浙江天杭生物科技股份有限公司)；MEM培养液(批号：8117272，gibco公司)；双抗(批号：J170012，Hyclone)；甲醛、冰乙酸、2,4,6-三硝基酚、氢氧化钾、甘油、水合氯醛、茜素红等均为国产分析纯。

表1 铁皮石斛叶产地

1.3 仪器 LS-C0150 CO2培养箱(Thermo Fisher Scientific)；GHP-9270隔水式恒温培养箱(上海飞越实验仪器有限公司)；GHP-9270倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；1510酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；AU480全自动生化分析仪(Beckman Coulter)；M-series全自动血液细胞分析仪(Medonic)；ACL7000血凝分析仪(美国实验仪器公司)；H-500尿液分析仪(迪瑞)；YZ6H检眼镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 急性经口毒性试验 急性经口毒性试验参考GB 15193.3-2014《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》限量法[8]。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1 细菌回复突变试验(Ames试验) 细菌回复突变试验参考GB 15193.4-2014《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》平板掺入法[9]。

2.2.2 哺乳动物红细胞微核试验 哺乳动物红细胞微核试验参考GB 15193.5-2014《食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验》[10]。

2.2.3 体外哺乳细胞染色体畸变试验 体外哺乳细胞染色体畸变试验参考GB 15193.23-2014《食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验》[11]。

2.3 90 d经口毒性试验 大鼠90 d经口毒性试验参考GB 15193.13-2015《食品安全国家标准 90天经口毒性试验》[12]。

2.4 致畸试验 大鼠致畸试验参考GB 15193.14-2015《食品安全国家标准 致畸试验》[13]。

2.5 实验数据统计 研究数据均采用Excel录入，利用SPSS 16.0软件开展统计学分析。计量资料符合正态分布，方差齐者采用T检验，若方差不齐采用秩和检验。其中，遗传毒性试验结果中，染色体畸变率的比较使用卡方检验，微核率的比较使用泊松分布法。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 急性经口毒性试验 铁皮石斛叶[剂量：10 g/(kg·bw)]经口染毒后，两周内未见动物死亡，亦无明显的中毒症状或不良反应，即样品对雌、雄性SD大鼠的急性经口LD50>10 g/(kg·bw)，判属实际无毒级别。详见表2。

表2 铁皮石斛叶对SD大鼠的急性经口毒性试验结果

3.2 遗传毒性试验

3.2.1 细菌回复突变试验(Ames试验) 无论加与不加S9的试验，自发对照组的每皿平均回变菌落数均在正常值范围内，而阳性对照组诱发的每皿平均回变菌落数均为自发对照组2倍以上，呈明显阳性反应。铁皮石斛叶各剂量组和溶剂对照组的平均回变菌落数均未超过自发对照组的1倍，呈阴性反应，即样品无诱导试验菌株回复突变的作用。详见表3和表4。

表3 铁皮石斛叶细菌回复突变试验结果(第一次) (个/皿，

表4 铁皮石斛叶细菌回复突变试验结果(第二次) (个/皿，

3.2.2 哺乳动物红细胞微核试验 受试物各剂量组PCE/200比值与阴性对照组的差异均在20%以内，经统计无显著性差异(P>0.05)，表示铁皮石斛叶对小鼠骨髓细胞增殖无不良影响。结果显示：阳性对照组雌、雄动物的微核率均显著高于阴性对照组(P<0.01)，受试物各组的微核率与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)，表明铁皮石斛叶在小鼠骨髓细胞微核试验中为阴性结果。详见表5。

表5 铁皮石斛叶对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

3.2.3 体外哺乳细胞染色体畸变试验 经计算受试物对CHL细胞的IC50在-S9条件下为1.03 mg/mL，在+S9条件下为1.44 mg/mL。试验中加或不加S9时，阳性对照细胞染色体畸变率均显著高于阴性对照(P<0.05)，且畸变率均>10%，呈明显阳性反应。各剂量组细胞染色体畸变率与阴性对照比较无显著性差异(P>0.05)，且畸变率均<5%，表明铁皮石斛叶在本实验条件下，未引起体外培养的CHL细胞染色体畸变。详见表6。

表6 铁皮石斛叶对CHL细胞染色体畸变率的影响

3.3 90 d经口毒性试验 大鼠90 d经口毒性试验期间，对照组和3个剂量组动物摄食、饮水、大小便正常，生长发育情况表现良好，试验前后眼部检查无异常，未观察到明显行为改变和中毒表现。大鼠体重、食物利用率、血液学、生化指标、尿液指标、脏器重量和脏体比等指标未见损害性影响；实验动物大体检查及组织学检查均未见由受试物引起的损害性改变。铁皮石斛叶实际摄入的最大未观察到有害作用剂量雄鼠为8.37 g/(kg·bw)(人体推荐摄入量的112倍)，雌鼠为8.73 g/(kg·bw)(人体推荐摄入量的116倍)。

3.4 致畸试验 铁皮石斛叶经口灌胃后各剂量组孕鼠均未见异常行为和中毒表现，各剂量组胎鼠体重、身长和对照组比较, 其差异均无统计学意义(P>0.05)。各组胎鼠均有胸骨缺失，未见胎鼠外观畸形、内脏畸形的发生，故认为铁皮石斛叶在最高剂量为人体推荐摄入量50倍[3.75 g/(kg·bw)]时，对母体无毒性作用，对胎鼠无致畸作用。

4 讨论

急性经口毒性试验结果表明铁皮石斛叶对SD大鼠急性经口LD50>10 g/kg·bw，判属实际无毒级别；铁皮石斛叶的三项遗传毒性试验(细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验和体外哺乳细胞染色体畸变试验)结果均为阴性，无致突变作用；大鼠90 d经口毒性试验提示在本试验条件下，设计最高剂量为人体推荐摄入量的100倍，实际摄入最高剂量雄鼠为112倍，雌鼠为116倍，铁皮石斛叶未引起大鼠的整体健康状况、生理生化功能和器官组织形态学等各项重要指标的异常变化。铁皮石斛叶实际摄入的最大未观察到有害作用剂量雄鼠为8.37 g/(kg·bw)(人体推荐摄入量的112倍)，雌鼠为8.73g/(kg·bw)(人体推荐摄入量的116倍)；大鼠致畸试验证实最高剂量为人体推荐摄入量50倍[3.75 g/(kg·bw)]，铁皮石斛叶对母体无毒性作用，对胎鼠无致畸作用。

随着国家卫生健康委、国家市场监管总局联合印发《关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》文件出台，以及贵州省卫生健康委关于《食品安全地方标准 铁皮石斛叶(干叶)》[14]发布实施，标志着铁皮石斛叶、铁皮石斛可在一定范围内作为食品原料合法使用，今后，以铁皮石斛叶、铁皮石斛为原料的食品研发将迎来前所未有的机遇。