高星，丛慧敏，张雪林，水明

（北京奶牛中心，奶牛遗传育种与繁殖北京市重点实验室，农业农村部奶牛遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100192）

测定原料乳中的尿素氮（以下简称为MUN）不仅可以监测奶牛日粮能氮平衡、蛋白质需要量和氮利用率，还可以作为提高奶牛繁殖性能的指标，加快奶牛遗传育种进展，因此MUN的测定对奶牛养殖具有重要意义。目前MUN的测定方法主要有酶法和化学法、红外光谱法[1,2]。酶法是一种间接测定方法，其测定原理主要是通过采用酶处理原料乳后产生的氨的变化来计算MUN值。即利用尿素酶将尿素分解成氨和二氧化碳，之后加入染色液和激活液形成绿色的络合物，其络合物颜色的强度与氨的浓度即MUN的浓度成比例。此法虽然操作繁琐，但是测定准确，灵敏度较高。化学法是通过加入特定化学试剂与尿素反应生成有色物质，然后通过比色法测定，是一种直接测定方法。红外光谱法是在通过尿素在某一区域出现官能团的特征吸收峰进行测定，其操作简单，虽然使用的分析仪器价格高，但适合快速分析，是国内外进行奶牛生产性能测定（DHI）时普遍采用的方法。这种物理方法检测灵敏度低，易受干扰，所以准确性不高，因此需要利用酶法或者化学法的测定值定期对红外光谱仪MUN测定值进行校准。本研究建立了一种对红外光谱法快速测定尿素氮仪器（以下简称红外尿素氮测定仪）进行校准的方法，并对校准后的仪器在牧场的大量测定数据进行了应用分析。

1 校准方法

酶法因为考虑了原料乳中氨的空白影响，因此更适合作为红外尿素氮测定仪的校准方法。本研究通过对生乳进行稀释和添加尿素的方法得到一个合理的线性浓度范围，先用酶法进行准确的测定，得到一系列MUN校准值，再对红外尿素氮测定仪进行校准。

1.1 原料乳的选择

选择脂肪含量在5%以下的新鲜原料乳3kg左右进行稀释或添加尿素。原料乳的MUN值在10mg/dL左右。

1.2 尿素标准溶液的配制

称取尿素1g左右，加水定容到100mL。计算MUN值的浓度为5.0mg/mL左右（尿素中氮元素的质量分数为46.62%）。

1.3 MUN校准系列溶液的配制

分别移取尿素标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL至250mL容量瓶中，用选定的原料乳定容至刻度。在另外两个250mL容量瓶中分别加入50mL水和80mL水，再用选定的原料乳定容至刻度，使得校准系列溶液浓度范围在6～26mg/dL。这是根据原料乳中的MUN常见范围以及美国、加拿大、欧洲和我国的参考标准确定的[3]。另外要注意使用酶法定值时不要加入任何防腐剂，避免因为防腐剂带来的颜色影响定值准确性，因为该法实际是一种比色法。用酶法平行测定以上校准系列溶液得到的校准平均值见表1。

表1 校准系列溶液MUN值 单位：mg/dL

1.4 对红外尿素氮测定仪进行校准

先使用红外尿素氮测定仪对1.3中的MUN校准系列溶液进行测定。测定前根据防腐剂在奶样中的比例加入到校准系列溶液中，主要是考虑与样品测定时的背景保持一致。因为从牧场采集的原料乳中通常是需要加入防腐剂的，以防止腐败。然后再根据红外尿素氮测定仪的校准软件程序将1.3中的系列校准值输入仪器，进行校准。校准结果如下：线性方程Y=0.9169X+0.6512，相关系数R2=0.9864。校准结果见图1。

图1 MUN校准曲线图

1.5 校准结果分析

依据线性方程和相关系数，可以看出当MUN浓度范围在6～26mg/dL时呈线性关系。MUN是DHI的重要指标之一，所以为了保证该数据的准确性，一定要定期开展对红外尿素氮测定仪的校准工作。建议每1～3个月校准一次。

2 应用红外尿素氮测定仪对牧场MUN测定数据的分析

北京奶牛中心生产性能测定实验室使用经过校准后的红外尿素氮测定仪对首农畜牧旗下管理的牧场和自有牧场测定的MUN数据进行了统计和分析。

2.1 季节因素对MUN值的影响

本研究对2021年全年的MUN数据进行了统计和分析，结果见表2。

表2 2021年MUN数据统计分析表 单位：mg/dL

MUN的群体平均意义大于个体值。根据国外的标准，美国将MUN值标准含量范围设定在10～14mg/dL；加拿大将MUN值标准含量范围设定在8～14mg/dL；欧洲将MUN标准含量范围设定在15～30mg/dL。由于我国在粗饲料质量方面与国外有一定差距，导致能氮不平衡，氮利用率低，使得MUN可能偏高，目前参考标准是10～18mg/dL。结合图表中全年的数据可以看出，基本都在正常范围内，只是夏季6月份和7月份的MUN值会偏低一些。作为反映日粮蛋白质供需平衡和日粮能氮平衡的指标，低MUN表示低的总蛋白吸收。如果是因为个别牧场日粮蛋白质不足，应该不会导致全部牧场的MUN值偏低，而且是6月份和7月份连续两个月都比较低。这可能是因为夏季高温导致奶牛群体体内消化酶活性降低，使蛋白质摄入量降低；而冬季牛群为抵抗低温需要消耗更多能量，从而使蛋白质摄入量增加，氨量也增加[4]。

图2 牧场MUN值变化趋势图

2.2 原料乳中脂肪含量对红外法MUN测定值的影响

根据《NY/T2659-2014牛乳脂肪、蛋白、乳糖、总固体的快速测定 红外光谱法》对一些原料乳进行测定之后，根据数据选取不同乳脂率的原料奶，再使用酶法测定MUN值，与红外法MUN测定值进行比对，结果见表3。

表3 红外法和酶法测定MUN的结果对比

对两种方法MUN测定差值进行对比研究时，发现差值与乳脂率呈正相关性（图3）。可以看出，随着乳脂率的升高，红外法MUN测定值越来越偏高。实际上当原料乳中脂肪含量大于5%以后，红外法和酶法的测定值就存在不小的差距了，之后随着乳脂率的升高，两种方法的测定差值越来越大，在乳脂率为5%～14%范围内二者呈正相关。这可能是由于脂肪球的存在影响了MUN官能团的红外特征吸收峰，使得测定值偏高。相对于脂肪、蛋白质和乳糖而言，MUN在原料乳中的含量很低，至少与前者相差100多倍，所以很容易受到这些含量高的大分子物质的干扰。但鉴于乳脂率大于5%的情况并不多见，所以在进行奶牛生产性能测定（DHI）时使用红外光谱法测定个体牛的MUN还是有一定准确度的。由于本试验中原料乳蛋白质和乳糖的含量通常都在正常范围内（2.0%～4.5%和4.0%～6.0%）起伏变动，可以认为具有相似的背景，避免了上述营养成分带来的背景差异。但同时本试验结果也无法证明过高的蛋白质和乳糖含量是否会对红外法MUN测定值有影响，因为很少见到蛋白质和乳糖含量异常的样品，而脂肪由于采样不规范或者其他因素会导致一些超出正常区间范围（2.5%～5.0%）样品的出现。

图3 乳脂率与两种测定方法差值的关系图

从本试验中也可以看出，用酶法测定MUN不受原料乳中脂肪含量的影响。黄文明[5]对化学法测定MUN的研究也表明，前处理过程脱脂与否不影响MUN的测定结果。另外Godden[6]、Jonker[7]等从奶牛的饲养环境和生产代谢方面进行的研究结果各不相同，有试验认为MUN值随乳脂率升高而降低，呈非线性负相关；也有试验认为没有强的相关性。但这些研究结果与本文的研究内容与结果不相冲突。本文是从两种不同测定方法的角度分析和讨论了乳脂率对MUN测定值的影响。

3 结论

通过应用红外尿素氮测定仪对牧场MUN测定数据分析，证明依据应用本文建立的校准方法定期对红外尿素氮测定仪进行校准，红外法可以用于反映牧场的日粮蛋白质水平、氮排泄量状况等信息。但应考虑季节因素以及个体牛的奶样中乳脂率大于5%时对红外法尿素氮测定值的影响。