李坤，赵孝凤，司敬方，代冬梅，王铭正，俞英，李凯扬，唐韶青，赵康，许维，柳咏雪，肖炜，张毅

（1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；2.北京市畜牧总站，北京 100107；3.天津嘉立荷牧业集团有限公司，天津 300404）

近几十年奶牛育种成效卓著，基因组选择技术加快了对优良基因的持续选择，使奶牛遗传性能稳步提升。但与此同时，奶牛近交程度也持续增加，遗传缺陷问题逐渐凸显[1]。遗传缺陷基因通过影响奶牛生长发育、降低繁殖效率、增加兽医成本等形式，给奶牛行业造成可观的经济损失[2]。

2015年，德国科学家在荷斯坦牛中发现一种与胆固醇缺乏相关的有害基因HCD (Holstein haplotype for cholesterol deficiency)，该遗传缺陷的患病犊牛表现为慢性腹泻和生长迟缓，药物治疗无效，同时患有继发性肺炎、水肿和低胆固醇血症，通常在出生后几天到数月内死亡[3]。全基因组关联分析将该遗传缺陷定位于牛11号染色体长1.01Mb的片段上，并推测可能与载脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）基因有关[4]。而后，全基因组测序揭示该遗传缺陷的致病机理是APOB基因内插入一个转座子（ERV2-1），导致APOB基因编码的载脂蛋白B被截短，从而造成了胆固醇代谢紊乱[5]。

HCD最初被认为是一种常染色体隐性遗传疾病，而研究者对不同基因型的犊牛及种公牛进行血液指标分析发现，不仅HCD纯合个体血液胆固醇浓度比野生型显著偏低，HCD携带者相较于野生型个体胆固醇浓度也低，甚至有些携带者表现了临床病症[6,7]。但到目前为止，相关研究所用样本量较少，HCD呈现的不完全隐性遗传模式还有待深入研究。国内学者最近研究证明HCD已传播进入中国荷斯坦牛群中[8,9]，但其对奶牛脂代谢的影响尚未有相关报道。本研究通过对比中国荷斯坦牛群HCD携带者和野生型个体之间的脂质代谢相关血液指标，探究HCD携带者的血液脂代谢规律，验证HCD特殊的不完全隐性遗传模式，同时为我国荷斯坦牛群HCD缺陷基因的管控提出建议。

1 材料与方法

1.1 试验动物

根据对北京市两家牛场（以下简称牛场A和牛场B）牛只的遗传缺陷基因型的筛查结果[9]，共挑选62头奶牛作为对照试验的样本，其中牛场A中HCD携带者和野生型各13头，牛场B中HCD携带者和野生型各18头。携带者与野生型个体之间的年龄、泌乳状态、健康状态、数量等因素都尽可能控制在相同水平。

1.2 血液指标检测

采取尾静脉采血的方式，每头牛采集5mL血液装入分离胶促凝采血管，立即颠倒混匀5次，静置后以3 000r/min离心5～8min（至分离胶将血清分离），用移液枪将上层血清吸入2个冻存管，每个管约1mL，放置于-20℃冰箱保存。血液指标检测通过全自动生化分析仪或半自动生化分析仪完成，包括葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）5项生化指标。

1.3 统计分析

采用Shapiro-Wilk法（R软件shapiro.test函数）进行数据正态性检验，发现5项血液指标数据均符合正态分布（P＞0.05）。HCD携带者和野生型各项血液指标的差异显著性检验采用配对t检验，血液生化指标之间的相关性用皮尔逊相关系数度量。

2 结果

2.1 血液指标间的相关性分析

对所有牛只5项血液生化指标之间的相关性分析显示（图1），TC、HDL-C、LDL-C之间的相关系数可达到0.85～0.96，即两两之间呈现强正相关关系，但TG和GLU、以及TG、GLU与TC、HDL-C、LDL-C三项指标之间的相关系数在0.6以下，观察不到强的相关性。

图1 血液指标相关性分析

2.2 日龄对血液指标的影响

在牛场A样本中，奶牛血液TG和GLU浓度均随日龄的增加而降低，而TC、HDL-C和LDL-C三项血液指标与日龄呈正相关关系，且野生型个体的血液TC、HDL-C和LDL-C浓度随日龄的增加表现出的增长幅度较HCD携带者更大。牛场B的数据显示，日龄对HCD携带者和野生型5项血液指标的影响趋势与牛场A类似，但其影响程度较牛场A小（图2）。

图2 日龄对所测5项血液指标的影响

2.3 HCD携带者与野生型血液指标差异分析

检测结果（表1）显示，牛场A中13头HCD携带者的TC浓度均值为3.14±1.28mmol/L，显著低于野生型的4.32±2.07mmol/L（P＜0.05）；同时，其LDL-C浓度（0.18±0.14mmol/L）也较野生型（0.38±0.21mmol/L）更低，且差异达到极显著水平（P＜0.01）。此外，HCD携带者的HDL-C、TG和GLU的平均浓度都比野生型更低，但差异不显著。总体而言，牛场A中HCD携带者的五项血液指标相比野生型呈现出不同程度的低水平。

牛场B的H C D携带者除了T G浓度（0.39±0.05mmol/L）接近于野生型（0.38±0.04mmol/L）外，其他四项指标也都表现出与牛场A相同的较野生型偏低的趋势，但差异均不显著（表1）。

表1 HCD携带者与野生型血液生化检验结果比较(平均值±标准差)

3 讨论

此前在荷斯坦牛中鉴定出的遗传缺陷基因（例如HH1～HH5，CVM，BS，BLAD）均呈常染色体隐性遗传模式，遗传缺陷纯合子发病，但携带者的生理表现完全正常，故只要在种公牛中淘汰缺陷基因，就能完全避免缺陷基因的不利影响。然而，HCD是一个截然不同的缺陷基因，本研究中HCD携带者各项血液指标都比野生型偏低，个别指标达到显著或极显著水平。这一现象与此前国外研究结果一致[4,7]，印证了HCD是一个不完全隐性的遗传缺陷基因，故携带者较野生型具有更高的脂代谢异常风险，需要针对其设计更合理的育种及管控方案。

目前认为，HCD的分子机理是APOB基因内发生转座子（ERV2-1）插入，造成APOB基因被截断，使其无法转录翻译为正常的载脂蛋白B而造成的[5]。而载脂蛋白B是低密度脂蛋白（LDL）的主要载脂蛋白，负责把胆固醇运往肝外组织；同时，LDL表面的载脂蛋白B能与细胞表面的特异性膜受体结合，介导胆固醇被细胞吸收[10]，因此载脂蛋白B是胆固醇运输和被细胞吸收的关键因素。HCD遗传缺陷导致无法合成正常功能的载脂蛋白B，阻碍了胆固醇的代谢[11]。本研究中HCD携带者母牛的血液指标LDL-C和TC水平都显著低于野生型（P＜0.01），说明HCD携带者的胆固醇代谢能力减弱，但其分子机制还不清楚，可能是由于携带者APOB基因仅有一个正常的等位基因，降低了载脂蛋白B的生物合成量，从而影响胆固醇的代谢能力。

本研究还探究了各项血液指标的相关性，发现TC、HDL-C、LDL-C两两之间都显示出较强的相关性。这是由于HDL-C和LDL-C都是由载脂蛋白和胆固醇结合形成的，而HDL-C和LDL-C起着运输胆固醇的作用[12,13]。此外，本研究发现HCD携带者的脂代谢指标在不同月龄都有比野生型偏低的趋势，鉴于年龄对血液指标的影响，本试验将其作为挑选配对样本的重要因素。

本研究中两个牛场的血液指标差异分析的结果存在差异，在牛场B中的统计结果并不显著，这可能是由于饲养环境和HCD作用机制等因素造成的。首先，表型是由遗传和环境效应共同作用的结果，饲养方式、饲料、环境等因素可以改善HCD携带者缺陷基因的不利影响。在血液检测结果中，牛场B的所有血液指标浓度都高于牛场A，这可能是因为牛场B的牛群营养水平较好，缩小了HCD缺陷基因造成的差异。另外，鉴于HCD表现为不完全隐性遗传模式，杂合子有不完全外显率[6]，意味着其他脂代谢相关基因可能也影响血液指标变化，导致统计结果并不显著。

HCD缺陷基因已经扩散到我国的牛群中。2021年，研究人员在1 633头中国荷斯坦牛群中检测到HCD携带频率为3.62%，在9种常见的遗传缺陷中属于较高的频率[9,14]。由于HCD携带者也可能存在一些脂代谢类疾病，甚至表现出缺陷纯合的临床症状，这比一般的遗传缺陷疾病造成更大的饲养管理上的成本，所以应当采取积极的管理措施，控制其负面影响。但因为某些HCD携带者是生产性能优异的个体，将其直接剔除得不偿失，反而会造成更大的经济损失[15]。因此，合理的HCD遗传缺陷基因管理策略应是尽早对奶牛群进行HCD基因检测，彻底淘汰HCD携带者公牛，逐步淘汰HCD携带者母牛。另外，在奶牛饲养中通过精准管理，提高HCD携带者的营养水平，降低出现脂代谢异常的风险。

4 结论

通过血液指标分析发现HCD携带者相比野生型血液中总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）偏低，且这3个指标具有较强的正相关关系。建议对国内种公牛进行HCD分子检测，彻底淘汰携带者公牛。奶牛场也应对HCD缺陷基因进行风险评估，筛查并逐步淘汰HCD携带者母牛，从而有效控制HCD遗传缺陷基因的负面影响。