唐玉利 刘欣 廖若夷

1.湖南中医药大学第一附属医院老年病科，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院护理部，湖南长沙 410208

压疮严重降低了患者生存质量[1-2]。单纯运用负压引流治疗压疮临床效果仍欠佳[3-4]。中医学中压疮应属“席疮”范畴[5]，运用中西医结合治疗本病可取得较好效果[6-7]。益气生肌合剂临床应用多年，在创面修复中取得较好疗效，本研究进一步探讨其对压疮大鼠模型皮损、血清炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，6～7 周龄，180～200 g，购自湖南中医药大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004，合格证号：43072663411 014472，自由摄食。

1.2 实验药物

益气生肌合剂由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供（批号：20210105，规格100 g/瓶）；三乙醇胺乳膏[法国Biafine Act 公司生产，注册号：（进）H20120425，规格：46.5 g/支]。

1.3 主要试剂与仪器

p38 丝裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activatedproteinkinase，p38 MARK）抗体（CST，批号：8690P）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体（CST，批号：65373P）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP-9）抗体（CST，批号：D6O3H）；PBS（Hyclone，货号：80334412）；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）IL-2、IL-12、CRP 试剂盒（武汉博士德生物，货号：EK0404、EK0421、EK1316）。蛋白电泳仪（北京六一，型号：DYY-2C），其余仪器耗材由实验室提供。

1.4 动物分组

将大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、三乙醇胺乳膏组、益气生肌组、联合用药组，每组10 只。

1.5 压疮大鼠模型的建立

参照姜丽萍等[8]的压疮大鼠模型建立方法制备压疮大鼠模型，假手术组仅同部位埋入磁铁不予压力装置加压。

1.6 动物给药

根据人等效剂量换算[9]将大鼠益气生肌组给药剂量设定为12.98 g/（kg·d）。假手术组与模型组给予生理盐水0.4 ml 灌胃；三乙醇胺乳膏组大鼠予三乙醇胺乳膏外用，2 次/d；益气生肌组予益气生肌合剂灌胃，1 次/d；联合用药组为上述药物联合使用各组均连续干预8 d。

1.7 标本采集

最后一次给药1 h 后，于眼眶处取血约1.0 ml，4℃环境下1 500 r/min 离心5 min，离心半径16 cm，取上清置于-20℃冰箱备检。断颈处死后取各组大鼠皮损部位组织备检。

1.8 观察指标

1.8.1 形态学观察 观察各组大鼠干预前后的皮损情况，皮损面积（cm2）计算方法为最大长度（cm）×最大宽度（cm）。

1.8.2 病理观察 取各组大鼠皮损组织制备石蜡切片，苏木精-伊红染色后显微镜下观察病理情况。

1.8.3 血清炎症因子检测 ELISA 测定各组大鼠血清白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。严格按照试剂盒说明书操作，借助酶标仪进行检测。

1.8.4 p38 MARK 信号通路蛋白检测 提取各组大鼠皮损组织总蛋白，加入SDS 缓冲液煮沸5 min 使蛋白变性。凝胶电泳转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭孵育1 h，添加一抗抗体p38 MARK（1∶5 000）、VEGF（1∶500）、MMP-9（1∶1 000）和β-actin(1∶1 000），4℃过夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min。室温孵育二抗2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。显色后以β-actin 作为内参，计算各蛋白灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件处理数据，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组创面形态学观察

干预8 d 后，假手术组大鼠皮肤创面结痂已脱落，皮肤颜色恢复正常；模型组大鼠见压疮皮损愈合缓慢，其余各组大鼠的压疮皮损均存在不同程度的愈合结痂。见图1。

图1 各组创面形态学情况

2.2 各组皮损面积比较

假手术组大鼠的创面在第8 天已完全愈合。三乙醇胺乳膏组、益气生肌组、联合用药组造模第8 天皮损面积低于模型组，联合用药组造模第8 天皮损面积低于三乙醇胺乳膏组、益气生肌组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组皮损面积比较（cm2，）

表1 各组皮损面积比较（cm2，）

注 与模型组比较，aP＜0.05；与三乙醇胺乳膏组比较，bP＜0.05；与益气生肌组比较，cP＜0.05

2.3 各组皮损组织病理学情况

假手术组皮损组织细胞结构排列整齐，未见炎性浸润。模型组皮损组织周围存在明显的炎性浸润及坏死碎片，组织可见明显的空泡变性；其余各组可见皮损组织炎性浸润明显缓解，坏死碎片及空泡化现象明显减少，其中联合用药组缓解程度最佳。见图2。

图2 各组皮损组织病理学情况（HE 染色，200×）

2.4 各组血清炎症因子水平比较

模型组IL-2、IL-12、CRP 血清炎症因子水平高于假手术组（P＜0.05）；三乙醇胺乳膏组、益气生肌组、联合用药组IL-2、IL-12、CRP 血清炎症因子水平均低于模型组，且联合用药组低于三乙醇胺乳膏组、益气生肌组（P＜0.05）。见图3。

图3 各组血清炎症因子水平比较（n=10）

2.5 各组皮损组织p38 MARK、VEGF、MMP-9 的蛋白表达情况

模型组皮损组织p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表达水平高于假手术组（P＜0.05）。三乙醇胺乳膏组、益气生肌组、联合用药组皮损组织p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表达水平均低于模型组，且联合用药组皮损组织p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表达水平低于三乙醇胺乳膏组、益气生肌组（P＜0.05）。见图4。

图4 各组皮损组织p38 MARK、VEGF、MMP-9 的蛋白表达情况（n=10）

3 讨论

压疮多以局部肌肤坏死溃疡，创面迁延难愈等为特征[10-11]。中医学认为本病治疗的总体原则为扶正祛邪，标本兼治[12-16]。p38 MAPK 信号通路与压疮的炎性机制联系紧密，p38 MAPK 信号通路激活后，IL-2、IL-12、CRP、肿瘤坏子因子-α 等炎症因子大量释放，对皮损组织的病理性重构起到了极为重要的调控作用[17-19]。与p38 MAPK 信号通路密切相关的VEGF、MMP-9 等因子所介导的血管平滑肌细胞增殖，参与了结缔组织增生与局部的血管重建与再塑，同时p38 MAPK 信号通路能够密切参与到细胞增殖、分化、凋亡及相关炎症反应中[20-23]。MMP-9、VEGF 是受p38 MAPK 信号通路调控的对细胞损伤与修复起重要调控作用的细胞因子[24]。p38 MAPK 信号通路紧密参与到细胞增殖、分化、凋亡及多种关键细胞因子合成等方面，在压疮的诸多生理病理调控中起到关键作用，是压疮的损伤与修复过程中的关键分子机制之一[25-26]。本研究治疗压疮提供新的思路与基础研究证据。

综上所述，益气生肌合剂与三乙醇胺乳膏联用可有效修复压疮大鼠模型皮损，降低血清炎症因子水平，其可能与益气生肌合剂调控p38 MAPK 信号通路密切相关。