童细焱 赵泰成

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）又称震颤麻痹，是一种多发于中老年人的神经系统变性疾病，以中脑黑质致密带腹外侧部的多巴胺能神经元大量变性和进行性缺失，以及神经元胞浆中Lewy 小体形成为特征性病理改变。神经疾病现在是全球残疾的主要来源，而世界上增长最快的神经疾病是帕金森病。随着社会老龄化，预计到2040 年将达到1 200 万以上[1-2]。PD 的研究已有190 多年，但其病因及致病机制仍未彻底明确，目前可能的相关因素有老龄化、环境工业和农业污染、遗传因素、线粒体功能障碍、氧化应激和泛酸-蛋白酶体系统功能异常等[3]。

miRNA-451 是近年发现的一种多功能miRNA，目前已证实其在血液系统疾病、神经发育、心血管疾病及肿瘤等方面具有重要作用。研究者在对帕金森病轻度认知障碍患者的血浆外泌体miRNA 筛选分析中发现miRNA-451 在帕金森患者血浆外泌体中的表达明显高于健康对照组[4]。但是miRNA-451在PD 发生与进展中的作用机制尚不明确。

本研究以鱼藤酮处理PC12 细胞建立的帕金森病细胞模型为研究对象，通过瞬时转染技术，在PC12 细胞损伤模型中分别抑制和增强miRNA-451的 表达，采用Real-time PCR 检测miRNA-451对Bcl-2、Bax 的表达水平的影响，旨在分析miRNA-451 对帕金森病细胞模型凋亡的影响，为以miRNA-451 为靶点的帕金森病治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12 细胞系购买于凯基生物技术股份有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清（四季青）；DMEM 培养基、胰蛋白酶（Gibco 公司）；鱼藤酮（rotenone）、二甲基亚砜（Sigma 公司）；miRNA-451模拟物（miRNA-451 mimics）、miRNA-451 抑制剂（miRNA-451-inhibitor）、无义序列及实时荧光定量PCR 所需引物（均由上海生物工程有限公司合成）；总RNA 提取试剂盒（北京TIANGEN 公司提供）；Lipofectamine 2000、Trizol 试剂（invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa 公司）。RT 反应使用新加坡ABI2720 型PCR 仪，PCR 检测采用杭州博日FQD-96A Realtime PCR system 进行。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和药物配置 PC12 细胞培养于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的高糖DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养细胞，每隔2～3 天用0.125%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞实验。鱼藤酮用二甲基亚砜（DMSO）配制成1 mmol/L 储存液于常温避光保存，然后稀释成所需浓度使用。

1.3.2 MTT 法筛选鱼藤酮最佳处理浓度 收集对数期PC12 细胞，调整细胞悬液浓度为5×104/mL，96 孔板中每孔加入100 μL，置5% CO2、37 ℃条件培养箱中12 h，至细胞融合度达80%时，每孔加入100 μL 不同浓度的鱼藤酮（0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L），均设5 个复孔。于5% CO2，37 ℃培养箱中培养24 h 后，每孔加入20 μL，5 mg/mL MTT，继续培养4 h 后，弃除培养板孔中培养液，加入DMSO 溶液150 μL/孔，置恒温摇床上低速摇匀10 min，至结晶颗粒完全溶解。利用酶联免疫检测仪，波长OD 570 nm 条件下测量吸光值。计量公式：细胞存活率（%）=（OD 实验组/OD 对照组）×100%。

1.3.3 PC12 细胞损伤模型的建立 将PC12 细胞接种于96 孔板中，浓度为5×104/mL，待细胞融合80%后弃去培养液，加入含鱼藤酮（1 μmol/L）的DMEM 培养液（含10%胎牛血清）。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，即可造成损伤模型。

1.3.4 分组与转染 鱼藤酮处理后，细胞继续培养24 h 进行转染。采用LipofectamineTM2000 转染试剂盒，按说明书步骤进行细胞转染。转染时将1×105/mL 密度的PD 细胞模型接种于6 孔板中。实验分为四组：阴性对照抑制剂组（PD 细胞模型+inhibitor-无义序列，inhibitor-NC组）、miRNA-451 抑制剂组（PD 细胞模型+miRNA-451-inhibitor，miRNA-451-inhibitor组）、阴性对照模拟物组（PD 细胞模型+mimics-无义序列，mimics-NC组）及miRNA-451 模拟物组（PD 细胞模型+miRNA-451-mimics，miRNA-451-mimics组）。

1.3.5 Real-time PCR 检测miRNA-451、Bcl-2、Bax的表达水平转染效率的检测：细胞转染后继续培养72 h 后，收集各组细胞，采用Trizol 试剂提取细胞总RNA，按试剂盒说明书分别进行cDNA 合成和以miRNA-451 和U6 引物进行Real-time PCR 检测，设立3 个复孔，以U6 作为内参。Bcl-2、Bax 表达水平检测：提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，以Bcl-2、Bax 引物进行Real-time PCR 检测，设立3个复孔，以GAPDH 作为内参。Real-time PCR 的结果用2-ΔΔCt计算。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR中所需引物序列

1.4 统计学处理 实验所得数据采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料用（）表示，使用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 法筛选鱼藤酮最佳处理浓度 0～100 μmol/L鱼藤酮处理PC12 细胞24 h 后，PC12 细胞存活率随着浓度的增高逐渐下降，呈浓度依赖性，细胞存活率以相对于载体的百分比来测量。1 μmol/L 鱼藤酮干预后细胞存活率为（49.4±3.0）%，与0 μmol/L鱼藤酮相比存活率降低（P＜0.05），见表2，图1。在后续实验中采用鱼藤酮的浓度为1 μmol/L。

表2 MTT法检测鱼藤酮对PC12细胞活力的影响

图1 鱼藤酮对PC12细胞活力的影响

2.2 细胞转染效率 在PC12 细胞损伤模型中转染miRNA-451 模拟物或抑制剂72 h 后，Realtime PCR 检测miRNA-451 的表达，与inhibitor-NC组（miRNA-451 表达量为1）相比，miRNA-451-inhibitor组miRNA-451 的表达量（0.27±0.05）明显降低（P＜0.01）；与mimics-NC组（miRNA-451表达量为1）相比，miRNA-451-mimics组中miRNA-451 的表达水平（12.95±2.33）明显升高（P＜0.01）。见图2。

图2 miR-451的表达水平

2.3 Real-time PCR 检测Bcl-2 和Bax mRNA 表达水平 miRNA-451-mimics组Bcl-2 mRNA 表达下调（P＜0.05），miRNA-451-inhibitor组Bcl-2 mRNA表达上调（P＜0.01）。miRNA-451-mimics组Bax mRNA 表达上调（P＜0.01）；miRNA-451-inhibitor组Bax mRNA 表达下调（P＜0.05）。见表3，图3。

表3 各组Bcl-2和Bax的mRNA表达水平（）

表3 各组Bcl-2和Bax的mRNA表达水平（）

*与GAPDH 比较，P＜0.05；**与GAPDH 比较，P＜0.01。

图3 Bcl-2和Bax mRNA表达水平

3 讨论

PD 是一种缓慢进展的神经系统变性疾病，发病初期若能及时诊断并给予正确治疗，多数患者发病数年内仍能有较好的生活质量或继续工作。PD被认为是一种病因不明的多病因疾病，特征性临床症状包括运动症状（静止性震颤、动作迟缓和肌强直等）和非运动症状（认知障碍、嗅觉障碍、睡眠障碍等）。随着社会老龄化，PD 的致残率和痴呆率逐年上升，患者的生活质量明显下降，并给患者的家庭及社会造成巨大负担。近年来在病理生理学和对症治疗方面已经取得了许多进展，但仍有一些至关重要的问题有待解决，其中最主要的是如何改变疾病进展。但目前的治疗方法无法改变疾病的进展，因此PD 的防治研究应引起广泛重视[5-6]。

鱼藤酮是植物毛鱼藤的有效成分，目前被广泛用作杀虫剂，作为一种特效的线粒体复合物Ⅰ抑制剂，通过抑制线粒体呼吸链电子传递，导致细胞线粒体功能丧失，细胞氧化应激增强，最终诱导细胞凋亡，长期接触可引起多巴胺神经退行性病变。线粒体功能障碍是PD 发病的关键机制[7]。因此，鱼藤酮常用于PD 研究的动物和细胞模型建立[8-9]。

PC12 细胞是一种来源于大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，具有神经分泌（儿茶酚胺、多巴胺和去甲肾上腺素）、离子通道和神经递质受体的功能[10]。在常规条件下可作为一种儿茶酚胺样细胞，具有增殖细胞的一些特性。但在神经生长因子的诱导下可增殖和分化为神经元样细胞，具有神经元相似的形态、生理和生化功能，而且在常规条件下易于培养，因此PC12 细胞广泛应用于神经生物学模型[11-12]。

miRNA-451 位于人类17 号染色体上的一种双顺反子miRNA 基因位点，主要在红细胞中高度表达，其余组织和细胞中表达较低。研究发现miRNA-451 是一种肿瘤增殖的调节子，其不仅可以抑制多种肿瘤细胞的增殖而且能通过抑制肿瘤细胞分化来促进肿瘤细胞凋亡[13-15]。近年来研究者报道阿尔茨海默病、帕金森病和抑郁症等疾病中也存在着miR-144/451 的表达异常[16]。帕金森病病理主要表现为多巴胺能神经元的大量退化和进行性缺失。而神经元的死亡主要有凋亡、自噬性死亡和坏死几种形式。因此推测miRNA-451 可能与帕金森病的神经元凋亡有关[17-19]。

Bcl-2 是哺乳动物中重要的抗凋亡基因，Bax 是与Bcl-2 功能相对的基因，其不但能拮抗Bcl-2 的抑制凋亡作用，而且有直接促进细胞凋亡的功能；Bcl-2 和Bax 基因之间的平衡在细胞凋亡过程中有重要的调控作用[20-21]。

本研究通过鱼藤酮处理肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12 细胞，构建PD 细胞模型。将miRNA-451-mimic、miRNA-451-inhibitor 转入鱼藤酮损伤后的PC12 细胞模型中，采用Real-time PCR 检测各组细胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的表达变化，结果发现，miRNA-451-mimics组Bcl-2 mRNA 表达下调、Bax mRNA 表达上调，而miRNA-451-inhibitor组Bcl-2 mRNA 表达上调、Bax mRNA 表达下调。因此，推测miRNA-451 可以通过抑制Bcl-2、上调Bax mRNA 的表达来促进鱼藤酮诱导的PC12 细胞损伤模型凋亡。然而，miRNA-451 调控鱼藤酮诱导的帕金森病细胞模型凋亡的具体通路还需要进一步实验来验证。