杨匆匆，姚鹏，任文明，韩杰，徐玉节，程立

（皖南医学院弋矶山医院泌尿外科，安徽 芜湖 241001）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常见的肾癌之一，约占成人恶性肿瘤的3%［1］，发病率和死亡率呈逐年上升趋势［2-4］。由于RCC早期临床特征不明显，约有25%～30%的患者在明确诊断时已出现转移，而转移性RCC是一种难以治疗的恶性肿瘤［5］，5年生存率低于10%［6-7］。随着分子生物学技术的发展，微小RNA（miRNAs）的发现为癌症的研究开辟了新的窗口。miRNAs是高度保守的大约18～24个核苷酸的非编码RNA［8］，结合到mRNA的3＇UTR以调节基因表达［9-10］。它们已被证实参与多种生物过程，并在肿瘤发生和发展的调节中起关键作用［11-13］，被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。大量研究证明微小RNA-500（miR-500）的异常表达与肝细胞癌［14］、胃癌［15］、结直肠癌［16］、乳 腺 癌［17］、非 小 细 胞 肺 癌［18］、前 列 腺癌［19］等恶性肿瘤的进展相关。但鲜见miR-500与RCC相关的报道，本研究旨在探讨miR-500在RCC发生、发展中的作用，为RCC的发生发展机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集2020年1月至2021年2月在我院泌尿外科行手术治疗且经病理组织学确诊的36例RCC患者的肾癌组织和癌旁正常组织（可见RCC病灶外2.0 cm）。年龄30～86岁；男28例，女8例；T1期27例，T2期2例，T3+T4期7例。患者术前均未行放化疗，且所有患者均签署知情同意书。所有新鲜组织在切除后立即在液氮中快速冷冻保存。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 细胞培养选取miR-500表达水平较低的RCC细胞株ACHN和KETR3，均购自上海中科院细胞库。这2种细胞株保存在含有10%胎牛血清（FBS，美国Corning公司）的DMEM培养基（美国Gibco公司）中，并在37℃、5%CO2增湿培养箱中培养。

1.3 细胞转染miR-500过表达引物（miR-500 mimics）及阴性对照引物（negative control，NC）购自中国上海生工公司。肾癌细胞株ACHN和KETR3接 种 于6孔 板 中 并 培 养24 h后，用Lipofectamine 3000（美国Thermo公司）进行细胞转染。24 h后更换为新鲜培养液，转染48 h后收集细胞，提取RNA，然后使用qRT-PCR验证转染后2种细胞株miR-500的表达，U6作为内参照。miR-500上游引物：5'-ATCCTTGCTACCTGGGTGAGA-3'，下游引物：5'-GCTCTCGCTCTCAGAATCCTT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物大小为80 bp。程序95℃10 min、95℃15 s、60℃60 s、60℃20 s，40循环。

1.4 癌组织及癌旁正常组织中miR-500表达水平采用荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测，按照试剂盒说明书。

1.5 细胞增殖实验采用MTS法检测细胞增殖情况。在37℃、5%CO2环境中，将RCC细胞株ACHN和KETR3以1×104/孔 的 密 度 接 种 到96孔 板 中，DMEM培养基最终体积为100 μl，6个重复孔。过夜附着后，将每个孔的细胞用5 pmol/L miR-500 mimics或NC进行转染。孵育0、24、48、72 h后，用MTS法分析确定细胞活力。将MTS标记试剂（美国Promega公司）与新鲜DMEM培养基混合，并按照产品说明书孵育细胞2 h，使用VARIOSCAN FLASH（美国Thermo Fisher公司）在490 nm和690 nm波长下测量光密度，以此反映细胞增殖活性，并绘制细胞增殖折线图。

1.6 细胞迁移实验采用划痕实验检测细胞迁移能力。将RCC细胞株ACHN和KETR3均匀接种在6孔板中，并使用Lipofectamine 3000将miR-500 mimics和NC转染6 h。当细胞密度达到90%时，200 μl无菌移液管尖端划出清晰的划痕。然后将细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，并在无血清DMEM培养基中培养。在划痕形成0和24 h后用数码相机系统（日本奥林巴斯光学公司）获取图像。实验重复3次。

1.7 细胞凋亡实验运用流式细胞仪评价细胞凋亡程度。将细胞株ACHN和KETR3均匀接种到6孔板中。转染48 h后，根据说明书，收集每个孔的细胞，包括漂浮细胞，并用5 μl碘化丙啶（PI）和5 μl膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯（KeyGEN）染色。在30 min内，使用流式细胞仪（美国Beckman公司）对每个样品进行测量和分析。

1.8 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料采用配对样本t检验和独立样本t检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-500在肾癌组织中低表达36例RCC患者中29例癌组织中miR-500表达下调（图1A）；RCC癌组织中miR-500的平均表达水平显著低于癌旁正常组织（P＜0.01）（图1B）。

图1 RCC癌组织和癌旁正常组织中miR-500的表达

2.2 转染结果qRT-PCR结果显示转染ACHN和KETR3细胞后，miR-500 mimics组miR-500的表达分别是NC组的（97.79±22.06）倍和（73.71±15.16）倍，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 ACHN、KETR3细胞转染结果

2.3miR-500抑制RCC细胞的增殖MTS法结果显示，miR-500 mimics组ACHN和KETR3细胞在24、48、72 h时，miR-500 mimics组细胞增殖速率较NC组明显降低（P＜0.05）。见图3。

图3 miR-500抑制ACHN（A）和KETR3（B）细胞的增殖

2.4miR-500抑制RCC细胞的迁移划痕实验结果显示，在转染后24 h，与NC组比较，miR-500 minics组ACHN细胞和KETR3细胞的迁移距离分别减少了（32.06±16.92）%和（63.16±35.88）%（P＜0.05）。见图4。

图4 miR-500抑制ACHN和KETR3细胞的迁移

2.5miR-500诱导RCC细胞凋亡流式细胞术检测结果显示，转染miR-500 48 h后，miR-500 minics组的ACHN细胞凋亡率较NC组细胞凋亡率显著升高，分别为（19.10±1.89）%和（9.76±1.95）%（P＜0.01）；KETR3细胞的相应凋亡率分别为（9.85±0.28）%和（6.32±0.70）%（P＜0.01）。见图5。

图5 miR-500诱导ACHN和KETR3细胞凋亡

3 讨论

肿瘤发生与多种基因的序列性改变有关，包括癌基因的激活和抗癌基因的功能障碍。大约50%以上的miRNAs基因位于与多种肿瘤相关基因区域或脆弱基因位点，这表明了miRNAs在诸多肿瘤的发生发展、迁移、增殖、凋亡等方面均有着重要生物学功能。一些miRNAs在RCC中表达明显上调，如miR-210、miR-155和miR-21；另一些miRNAs，如miR-708和miR-145则表达降低［20］，这表示miRNAs不仅具有肿瘤促进作用，亦可能具有肿瘤抑制作用。

人类已发现miR-500在许多恶性肿瘤组织中的异常表达，并在癌症发展中起着关键作用。如有研究发现miR-500表达在胃癌组织中明显上调，但在正常胃组织中相对较低。结果表明miR-500通过激活核因子NF-κB信号传导通路诱导胃癌细胞增殖和抗凋亡［15］。也有研究发现抑制miR-500，可以显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和黏附，并诱导非小细胞肺癌细胞凋亡［18］。有报道miR-500在肝细胞癌患者的血清和肿瘤组织中大量表达，但在肿瘤切除后可恢复至基线水平［14］。也有实验证实miR-500的靶向敲低显著提高了前列腺癌细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白1B（LRP1B）的水平，使前列腺癌细胞周期停滞在G1期，进而抑制细胞增殖［19］。此外，长链非编码RNA LINC00641靶向调控miR-500的表达抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭［16］。然而，关于miR-500在RCC中的表达特征或功能机制知之甚少。

本研究首先采用qRT-PCR技术检测36例RCC癌组织和癌旁正常组织中miR-500的表达水平，结果显示RCC癌组织中miR-500表达水平显著低于癌旁正常组织，这说明miR-500有可能是一种调控RCC发展的抑癌基因。为了进一步探讨miR-500水平对RCC发展的影响，本研究通过将2种RCC细胞系ACHN和KETR3进行miR-500过表达后，分析了miR-500上调对RCC细胞增殖、迁移和凋亡的作用。结果表明，miR-500上调显著抑制了2种RCC细胞的增殖与迁移能力，并诱导了细胞凋亡增加。研究结果对miR-500在RCC发生发展、迁移、增殖、凋亡等方面中的作用及可能机制提供了全新思路。

综上所述，在RCC细胞系ACHN和KETR3细胞中，miR-500能抑制其增殖和迁移，诱导凋亡增加，在RCC中发挥着重要生物学作用。miR-500可能是未来RCC生物治疗的新靶点，应进一步研究探索miR-500的生理作用及靶基因。