畜禽肉是大多数人获取蛋白质的主要来源，20世纪90年代以来，世界肉类消费量迅猛增长，中国占世界肉类消费总量的近1/3，肉类食品的安全问题也一直是民生关注的热点问题[1-2]。一些不良商家为了牟取利益，会在肉制品中掺杂比较低廉的肉源，甚至直接使用低廉肉源代替比较昂贵的肉制品，常见的如在牛、羊肉中掺入价格较低廉的猪肉等。

肉制品的掺假掺杂，不仅损害了消费者的权益，还有可能引发宗教冲突等问题；甚至可能给消费者带来健康风险，包括食物过敏和中毒等。目前肉类的检测技术主要有基于形态学、代谢学、蛋白质学和基因学原理的方法[3-4]。形态学方法主要是通过肉制品外观（肌理脂肪等颜色和分布）、气味和味道对肉类进行初步的判断，这类方法主观判定因素较多，依赖丰富的经验，且对于深加工的肉制品难以辨别；近红外光谱和核磁共振技术等也应用于肉类鉴定，结果准确，检测时间短，但仪器操作成本高，对专业技术要求较高，还有较多限制因素[5-7]；蛋白质学的鉴定包括电泳分析法、色谱法和免疫分析法等，是基于肉类中一些特异性的纤维蛋白、血浆蛋白和酶等进行鉴定，但对深加工的肉类鉴定有局限性（蛋白质的变性等因素）；基于基因组学的聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reation，PCR)是最常用的肉类鉴定技术，主要依据不同动物源线粒体中细胞色素b基因（Cytb）、COXⅠ基因、ATPase8基因、12S rRNA基因等特异性的原理进行检测[8]。近年来，多重和荧光PCR技术的应用大大提高了鉴定效率，数字PCR还可以对掺假掺杂肉类进行定量检测[9-10]。已有不少地区使用PCR技术考察了当地（区）肉及肉制品的掺假掺杂情况[11-14]。本文采用PCR方法对南宁市市场肉类产品成分进行采样检测调查。

1 材料与方法

1.1 样品

将采集的样品分为A生鲜肉制品、B加工肉制品、C混合肉制品3类，均购自南宁市，样品信息见表1。

表1 采集样品类型及数量表

1.2 仪器与试剂

TAKARA肉及肉制品提取试剂盒（DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products CN：9178）；TAKARA鸡基因检测试剂盒（CN：RR916）；TAKARA鸭基因检测试剂盒（CN：RR934）；Taq DNA聚合酶等（TAKARA）；各标准引物和探针委托深圳华大基因科技有限公司合成。

GR110DR高压灭菌锅（美国致微）；Etuve电热鼓风干燥箱（法国Froilabo公司）；AC2-6S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；3-30K离心机（德国SIGMA公司）；数显恒温水浴锅（常州智博瑞公司）；Mastercycler nexus gradient PCR仪（德 国Eppendorf公司）；Light Cycler2.0实时荧光定量PCR仪（瑞士ROCHE公司）；BIO-RAD基础电泳仪（美国伯乐公司）；凝胶成像系统（美国伯乐公司）；Implen P-330核酸蛋白分析仪（德国Implen公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理及核酸提取

用经180 ℃干热灭菌2 h的剪刀处理样品，尽量取内部肉质，避免表面有其他污染干扰；表面调味品较多的样品，可用纯化水洗涤尽量去除杂质后提取；尽可能地剪碎样品。将剪碎的样品加入到TAKARA肉和肉制品提取试剂管中，按照说明书进行提取。提取后使用核酸蛋白分析仪检测DNA纯度及浓度。

1.3.2 成分检测方法

对样品中的猪、牛、羊、鸡和鸭5种肉源成分进行检测，标识或宣称成分为目标成分。各成分检测依据见表2。

表2 动物源性成分检测依据表

1.3.3 结果判定

荧光PCR检测方法中CT值＜30则判定检测出该成分，普通PCR经电泳检测有目标大小片段后，将PCR产物送测序，序列结果经NCBI比对，判定是否检出。其中，样品检出目标肉源成分及其他肉源成分的，判为“掺杂”；样品未检出目标肉源成分，判为“掺假”。

2 结果与分析

2.1 牛肉及牛肉制品

牛肉及牛肉制品检测结果汇总见表3。

表3 牛肉及牛肉制品检测结果表

2.1.1 鲜牛肉制品

鲜牛肉样品均与宣称成分相符，无掺假掺杂情况，结果见表4。

表4 鲜牛肉制品检测结果表

2.1.2 加工牛肉制品

32份加工牛肉制品中，有2份肉制品经检测为猪肉，分别为风干肉干、烧烤串样品；1份样品未检出猪、牛、羊、鸡和鸭成分，为油炸制品（含明显肉质）；4份肉制品检测含有牛肉和猪肉成分，主要为烧烤串，产品标签显示来源于同一冷冻制品批发商；有2份烧烤样品猪源性检测PCR在CT值＞28后有扩增，分析可能由于调料中带入或制作工具中交叉污染带入少量成分，未计入掺杂产品。详见表5。

表5 加工牛肉制品检测结果表

续表5

2.1.3 混制牛肉制品

12份样品中，1份样品显示几乎不含有5种目标肉源；1份样品与标签标识不符（标签标示肉源为牛肉，实际含有牛肉和猪肉）。详见表6。

表6 混制牛肉制品检测结果表

2.2 羊肉及羊肉制品

羊肉及羊肉制品检测结果见表7。

表7 羊肉及羊肉制品检测结果表

2.2.1 鲜羊肉制品

采集的12份鲜羊肉制品均检出羊源性成分，未检出其他4种肉源成分，见表8。

表8 鲜羊肉制品检测结果表

2.2.2 加工羊肉制品

共采集13份加工羊肉制品，其中4份样品经检测为猪肉制品，掺假率为30.8%，掺假情况比较严重，详见表9。其中2份掺假样品标签显示与2.1.2掺杂样品来源于同一家冷冻制品加工批发商。

表9 加工羊肉制品检测结果表

2.3 其他肉制品

样品为混制肉制品，主要为火腿肠。此次共采集样品10份，其中有6份与包装标识不完全相符，不符率为60%，其中5份为掺杂产品，1批为成分缺失样品，掺杂情况比较严重，详见表10。

表10 其他混制肉制品检测结果表

3 结论与讨论

（1）本次样品采集自南宁市市区几个大型菜市场、商超等主流肉源供应点，除了市场占有率比较大的主流品牌，还包括有一定客源的中小型商铺，样品有一定代表性。共对116份样品进行成分检测，其中掺假样品8份，掺假率为6.9%，羊肉制品掺假比例较高；掺杂样品10份，掺杂率为8.6%，主要为混合肉制品。详见表11。

表11 调查结果汇总表

（2）总体来看，鲜肉制品市场整体情况较好，未发现掺假掺杂情况。牛羊肉深加工的肉干及烧烤制品存在以猪肉掺假掺杂情况，此类样品经过深加工和大量调味品修饰，消费者已难以通过外观和口感进行辨别。火腿肠和肉丸等混制肉制品因混合淀粉类成分较多，无法表观判断，部分样品检测到的成分与标签标识成分不符，掺杂情况相对较严重。此次考察还发现个别涉嫌掺假掺杂的冷冻批发加工肉制品（烧烤串）在不同商铺出现，提示应把控好批发市场等源头市场，避免掺假掺杂产品在市场中流通。有两批样品未检测出猪、牛、羊、鸡和鸭5种肉源任何一种，提示监管部门抽检还需扩大检测范围，确定安全风险。

（3）提取核酸进行肉制品成分鉴定是目前比较可行且可靠的方法。本研究对TAKARA肉及肉制品提取试剂盒提取法、CTAB提取法和QIAGEN经典试剂盒提取法3种常用肉类核酸提取方法进行对比，发现TAKARA肉及肉制品提取试剂盒效果较好，且操作更为简便。使用该试剂盒对牛、猪样本中皮、筋、血、瘦肉、肥肉、肝脏、肚和骨髓等不同部位肉质组织进行核酸提取效果研究，结果表明除血块（已凝集）、皮质组织核酸提取效果较差，其他均可提取核酸完成后续PCR检测。

（4）现国内动物源性鉴定相关现行标准多为企业标准和地方标准，一般最低检测限为0.1%（W/W），有国家标准如《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法》（GB 38164—2019），检测对象比较全面，但检测限较高，为1%。此次考察基于本实验室条件主要依据荧光PCR技术的检验检疫行业标准进行，荧光PCR技术检测结果较准确、简便和稳定，但如鸡、鸭源性成分检测，行业标准目前主要为定性PCR法和重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification，RAA），经考察使用定性PCR同步结合商业试剂盒进行荧光PCR检测，商业试剂盒结果与定性PCR一致，但操作更简便，用时更短。未来检测技术会在精度和量化水平方面进行优化，如数字PCR、高通量测序等技术的应用[15-16]。