马东晓，衣姜乐，夏方诠，田 栋，周长利

（济南大学化学化工学院，山东 济南 250022）

农药对提高农作物质量和产量方面发挥着重要作用，随着农药的普遍应用，人们对农药残留的问题越来越重视，所以快速、精确地检测农药残留是目前研究的热门课题。啶虫脒作为一种常见的氯烟碱类农药，具有着较强的抗虫性和较低的哺乳动物毒性，被广泛的应用于生态防害。然而，啶虫脒的过量使用也会对水、农产品及土壤造成污染，对人类健康构成威胁。目前，农残检测方法有多种，如高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用等技术。这些技术提供了丰富的定性和定量信息，具有高度准确性。然而由于操作复杂性，繁杂的样品预处理，较高分析成本和时间消耗，极大的限制了这些方法在实际农残检测中的应用。电化学方法因微型化、操作简便、成本低、响应时间较快受到广泛关注。特别是生物电化学传感器在食品安全分析检测等领域显示出巨大优势。但是，在构建传感器过程中信号探针大都被固定于电极表面，电极的打磨、清洗、活化耗时且操作繁琐，重现性不高。其次，信号探针与靶的识别作用发生在电极与溶液之间的界面上，使得空间位阻作用增强、作用效率降低，这些不足在一定程度延长了完全作用时间，限制了传感器的实际分析应用。在均相电化学开展了一系列相关研究，利用免电极修饰传感策略实现了对目标物的高灵敏检测。Yang Limin等利用As（V）与CeO的结合力强于磷酸根与CeO之间的相互作用这一特性，发展了竞争配位的免电极修饰生物传感器用于As（V）的分析测定。利用亚甲基蓝标记的短链DNA（methylene blue-short strand DNA，MB-ssDNA）为信号探针，由于短DNA尺寸小且带有较少负电荷，可以自由扩散到带负电的铟锡氧化物电极表面，电化学信号增强。免电极修饰的传感策略避免了常规电极修饰的繁琐且耗时、核酸探针与目标物的作用效率低等缺陷，具有简单、快速、高特异性和高效率等优点。然而，在免电极修饰传感策略中，为了提高探针传质速率，往往需要在探针与目标物反应后，将探针分子与核酸复合物分离，这就会面临均相分离的难题。

有序介孔二氧化硅的磁性复合材料由于独特的磁性、生物相容性及反应活性，使其在生物磁分离、靶向药物的运输，免疫检测等方面受到特别关注。Wang Yanyan等通过在磁性介孔二氧化硅（magnetic mesoporous silica，MMS）内外壳中包裹CdTe量子点和罗丹明6G受体，构成多功能无机-有机纳米复合物，构建高选择性、可再生比率荧光传感器，用于高效测定、快速吸附及磁性分离去除Hg。盛伟通过对FeO@SiO进行氨基化改性，制备得到的FeO@SiO@EDPS经计算对DNA的最大吸附容量可达到210.22 μg/mg，表现出良好的DNA分离及纯化性能。

本实验利用具有优良磁性的MMS构建了免电极修饰的电化学适配体传感器，用于快速检测啶虫脒。通过在MMS表面氨基化改性并修饰金纳米粒子，使其与啶虫脒适配体结合，并通过杂交反应与标记有二茂铁（ferrocene，Fc）的cDNA反应，制备磁性复合物氨基化磁性介孔二氧化硅@纳米金-适配体-核酸互补链-二茂铁（amino magnetic mesoporous silica@gold nanoparticlesaptamer-complementary DNA-ferrocene，NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc）。在分析测定过程中，磁性复合物与啶虫脒在磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）中发生均相反应，释放出核酸探针cDNA-Fc。利用磁场效应将反应后的磁性复合物与释放出的探针分离，溶液中游离的cDNA-Fc探针传质到电极表面，产生电化学信号。根据加入啶虫脒前后电化学信号差值，实现啶虫脒的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲酸二茂铁（ferrocenecarboxylic acid，Fc-COOH）（纯度98%）、(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷（(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES）（纯度99%）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）（纯度99%）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（-(3-dimethylaminopropyl)-’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）（纯度98%）、-羟基琥珀酰亚胺（-hydroxysuccinimide，NHS）（纯度98%） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；六水合三氯化铁（FeCl·6HO）（纯度99%）、正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）（纯度98%）、乙二醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；实验中所用水为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）；所用PBS均为0.1 mol/L且pH 7.4，啶虫脒适配体及适配体互补链购自生工生物工程（上海）股份有限公司，序列如下：啶虫脒适配体：5’-NH-(CH)-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACC ATATTATGAAGA-3’；啶虫脒适配体的互补链：5’-NH-(CH)-CATAATATGGTGTCAGCG-3’。

1.2 仪器与设备

电化学工作站 上海辰华仪器公司；傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司；透射电子显微镜 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 材料制备

1.3.1.1 MMS的制备

称取1.35 g FeCl·6HO，3.60 g NaAc及0.33 g柠檬酸钠溶解于40 mL乙二醇中，充分搅拌后转移至高压反应釜，在200 ℃反应16 h。磁性分离得到FeO纳米粒子，用水和乙醇洗涤3 次，60 ℃真空干燥。

将0.05 g FeO充分分散在乙醇（20 mL）、超纯水（10 mL）及浓氨水（0.5 mL，质量分数28%）混合溶液中，超声处理30 min。向溶液中逐滴加入40 μL TEOS，机械搅拌6 h，进行磁性分离，得到单层SiO包裹的FeO。向以上产物中加入0.3 g CTAB、超纯水（40 mL）、浓氨水（0.6 mL，质量分数28%）和乙醇（30 mL）的混合溶液，超声处理30 min后滴加400 μL TEOS，在机械搅拌下保持反应6 h以涂覆第2层介孔二氧化硅，反应完成后收集产物。将产物转移至含有50 mL乙醇、0.50 g NHNO的三口烧瓶中，N保护条件下，80 ℃冷凝回流5 h，重复此洗涤过程3 次以上以除去CTAB，分离得到MMS，60 ℃真空干燥。

1.3.1.2 MMS的氨基化

将0.03 g MMS加入到圆底烧瓶中，再加入50 mL乙醇、40 μL APTES。在80 ℃通入N保护并持续搅拌，反应12 h后，将制备的沉淀物用乙醇和水进行洗涤以洗去硅烷试剂，分散至10 mL超纯水中，制得氨基功能化介孔材料NH-MMS。

1.3.1.3 NH-MMS@Au NPs的制备

在持续搅拌下依次将氯金酸（170 μL、0.25 mmol/L）、冰NaBH溶液（0.6 mL、0.1 mol/L）按顺序加入到柠檬酸钠（19.40 mL、0.25 mmol/L）溶液中，于4 ℃的冰箱中静置老化6 h，成功制得Au NPs。

取400 μL 3 mg/mL氨基化介孔二氧化硅置于离心管中，加入12 mL金纳米粒子后在振荡器上振荡12 h，在9 000 r/min离心5 min，除去上清液，得NH-MMS@Au NPs复合物，分散在4 mL超纯水中，充分振荡均匀后备用。

1.3.1.4 二茂铁-DNA互补链（ferrocene-complementary DNA，Fc-cDNA）探针的制备

称取0.23 g Fc-COOH（0.001 mol），在持续搅拌下加入到16.0 mL的超纯水中，后加入2.0 mL EDC（4.0 mmol/L）和NHS（1.0 mmol/L）混合溶液，搅拌过夜以活化Fc-COOH的羧基基团，超声分散均匀后9 000 r/min离心5 min，后分散在10 mL超纯水中，取1 mL上述溶液稀释10 倍备用。

将150 μL 10 μmol/L cDNA与100 μL 0.01 mol/L的上述溶液混合振荡均匀，在4 ℃环境下孵育12 h。

1.3.1.5 NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc的制备及纯化

将200 μL 10 μmol/L啶虫脒适配体与200 μL NH-MMS@Au NPs复合物充分混合均匀，在4 ℃环境下孵育12 h，制备得到NH-MMS@Au NPs-Apt复合物。将其与Fc-cDNA溶液混合，振荡均匀，于37 ℃孵育2 h。利用磁性分离，以PBS洗涤3 次以除去多余的Fc-cDNA探针。最后得到的NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc分散于10 mL PBS溶液中，备用。

1.3.2 传感器的制备与表征

准确移取2 mL NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc分散液于电解池中，加入不同浓度的啶虫脒标准液，搅拌下常温孵化30 min。将磁铁置于电解池底部，分离后，以处理好的裸玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为辅助电极，利用方波伏安（square wave voltammetry，SWV）法在0.1～0.5 V电位区间内扫描，记录所得数据。传感器构建过程如图1所示。

图1 免电极修饰适配体传感器构建过程Fig. 1 Flow chart for the construction of modification-free electrode aptasensor

1.3.3 电化学研究

分别在单独含有Fc、Fc-cDNA、NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc和NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc+啶虫脒的PBS溶液中用SWV法测其氧化峰电位及电流。

1.3.4 实际样品测定

为进一步考察构建的传感器在实际样品的分析性能，将制备好的传感器应用到实际样品的检测中。对超市购买的芹菜进行测试，首先分别准确称量100 g芹菜，用榨汁机榨成汁后，将样品分散在100 mL PBS中，离心样品并获得上清液，后按照所构建传感体系检测芹菜中啶虫脒。

2 结果与分析

2.1 材料表征

利用透射电子显微镜对FeO、MMS、NH-MMS@Au NPs材料进行形貌表征。由图2A可以看出，磁性FeO粒径为200 nm左右，分散均匀，大小匀称。由图2B可知，FeO包覆二氧化硅后，粒径变大，约为400 nm，有明显介孔结构。MMS氨基功能化后形貌无明显变化。NH-MMS@Au NPs的TEM如图2C所示，可明显看到金纳米粒子成功修饰在NH-MMS上，且结合良好。图2内插图表明FeO、MMS、NH-MMS@Au NPs均具有良好磁性。

图2 Fe3O4（A）、MMS（B）和NH2-MMS@Au NPs（C）的TEM图Fig. 2 TEM images of Fe3O4 (A), MMS (B) and NH2-MMS@Au NPs (C)

进一步对FeO、FeO@SiO、NH-FeO@SiO进行傅里叶红外光谱表征，如图3所示。三者均在583 cm出现了由Fe—O键振动引起的特征峰，MMS和NH-MMS的Fe—O键振动峰有所减弱，这是由于二氧化硅包裹或FeO部分氧化引起。由图3B可知，635、806、1 090 cm处Si—O—Si的特征峰可知，二氧化硅包覆成功。图3C中879、1 645 cm与N—H键弯曲振动和面外变形振动有关，在3 415、3 489 cm处产生的吸收峰则由N—H键对称与不对称的伸缩振动引起，表明MMS氨基化改性成功。

图3 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）和NH2-Fe3O4@SiO2（C）红外光谱图Fig. 3 FTIR spectra of Fe3O4 (A), Fe3O4@SiO2 (B) and NH2-Fe3O4@SiO2 (C)

2.2 探针电化学行为

众所周知，Fc在玻碳电极上可发生可逆的氧化还原反应。在0.1 mol/L的PBS中，用SWV法测定Fc的电化学行为，结果如图4曲线a所示，其氧化峰电位为0.3 V。以Fc标记短链cDNA，形成核酸探针cDNAFc后，其峰电流略有降低（图4曲线b）。但是，将其与NH-MMS@Au NPs-Apt杂交形成磁性复合物NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc后，峰电流明显降低（图4曲线c）。这是由于磁性复合物传质速率缓慢所致。当加入啶虫脒后，啶虫脒与NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc上适配体结合，而将cDNA-Fc探针释放出来游离在溶液中，峰电流升高（图4曲线d）。游离的cDNA-Fc探针产生峰电流的大小与啶虫脒浓度密切相关，据此可建立啶虫脒快速分析方法。

图4 Fc（a）、Fc-cDNA（b）、NH2-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc（c）和c＋啶虫脒（d）的SWV曲线Fig. 4 SWV curves of Fc (a), Fc-cDNA (b), NH2-MMS@Au NPs-AptcDNA-Fc (c) and c + acetamiprid (d)

2.3 孵化时间的选择

在其他条件不变情况下，向电解池中加入10 μL（10mol/L）啶虫脒，搅拌下常温孵化一定时间后，将磁铁置于电解池底部，测量SWV曲线氧化峰电流，结果如图5所示。在30 min之前，随孵化时间延长，越来越多的啶虫脒与适配体发生特异性结合，原有的双螺旋结构解开，释放出的cDNA-Fc探针增多，峰电流变大。当孵化时间超过30 min后，电化学信号无明显变化，说明30 min孵化反应完全，因此选择30 min为最佳孵化时间。

2.4 线性范围与检出限结果

测定不同浓度的啶虫脒时的SWV曲线，结果如图6所示。峰电流随啶虫脒浓度增大而升高，说明释放出的cDNA-Fc探针增加。当啶虫脒浓度达到5.6×10mol/L时，电化学信号不再变化。啶虫脒加入前后峰电流差Δ与浓度的对数（lg）呈良好的线性关系，线性方程为Δ= 0.041lg+0.535（=0.988），线性范围为0.055 pmol/L～5.5 nmol/L，检出限为3.2 fmol/L，与其他测定啶虫脒的传感器相比（表1），该传感器具有较高的灵敏度和较低的检出限。

图6 不同啶虫脒浓度的SWV曲线Fig. 6 SWV curves of acetamiprid at different concentrations

表1 各种啶虫脒传感器分析性能的比较Table 1 Comparison of analytical performance of various acetamiprid sensors

2.5 传感器的选择性

为考察制备免电极修饰传感器的选择性，分别使用5.6×10mol/L的草甘膦、多菌灵、毒死蜱、氯氰菊酯及含有啶虫脒的混合农药作为干扰物，并对溶液中加入各种农药后的电化学信号进行测定。由图7可以看出，加入啶虫脒和混合农药的峰值最大，这是由于传感体系中所用的啶虫脒适配体与啶虫脒发生特异性结合，而与其他农药不作用，所以当加入其他农药后，电化学信号几乎无变化。另外当加入混合农药时，结果表明其他农药对传感体系没有影响，说明该传感器对啶虫脒选择性好。

图7 传感器选择性Fig. 7 Selectivity of electrochemical aptasensor

2.6 实际样品的测定结果

为考察构建的传感器实际测定效果，以芹菜作为试剂样品进行测试。结果表明，啶虫脒回收率在101%～116%之间，相对标准偏差小于9.4%。该方法可作为实际样品中啶虫脒测定的参考方法，在环境和食品领域具有良好的应用前景。

表2 芹菜样品中啶虫脒的检测（n=3）Table 2 Recoveries of acetamiprid spiked in celery samples (n = 3)

3 结 论

构建了一种基于MMS的免电极修饰电化学适配体传感器，用于快速检测啶虫脒。MMS不仅提供了更多的靶结合位点，使得传感效率增强；而且其优良磁性实现了DNA复合结构的纯化、分离，提高了测试准确性。免电极修饰电化学适配体传感器避免了繁琐的电极修饰过程，缩短了测定时间，为食品中的农残快速检测提供了一种新思路，有着广阔的应用前景。