吕 敬，吴治勇，郭晓农，冯玉兰，卢建雄，柴薇薇

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

藜麦(Willd.)是藜科藜属植物，由于其原产自南美洲安第斯山脉，故又称南美藜。藜麦是印加土著居民日常生活的传统粮食，其栽培历史和食用历史据今已有5 000～7 000年之久。藜麦的氨基酸比例较接近联合国粮食及农业组织(FAO)提出的理想比例，蛋白质含量达到12%～23%。相比其他谷类粮食，藜麦的膳食纤维含量丰富，并富含多种矿物质、维生素等。目前，我国山西、吉林、河北、青海、甘肃等多个省份的藜麦种植面积已经达到一定规模，据统计，2019年甘肃省的藜麦种植面积已达60 km。

甘肃省地处黄土高原、青藏高原和内蒙古高原的交汇地带，境内高寒地区具有海拔高、昼夜温差大、环境质量优异、农耕文明悠久等得天独厚的藜麦种植条件，是发展藜麦产业的理想种植地区。在甘肃高寒山区发展藜麦种植业，在获得藜麦杂粮的同时，还可将藜麦秸秆收获后用于牛羊养殖业，再将牛羊粪便返回农田，形成有机循环农业，优势明显，开发前景广阔。

对于藜麦植株而言，整体占比较大的部位就是黎麦秸秆，成熟的藜麦秸秆高达2 m左右。目前，绝大部分的藜麦秸秆被焚烧，资源化利用率很低。未来，随着藜麦种植规模的扩大，大量的藜麦秸秆有待寻求更有效的途径进行开发利用。其实，藜麦秸秆的营养特性赋予了其独特的饲用优势。藜麦秸秆中的纤维素、蛋白质、脂肪含量接近玉米秸秆，而木质素含量却明显低于玉米秸秆，这些特性显著降低了藜麦秸秆用作饲料时木质素对动物胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶解抗性，使其具有柔软蓬松的性质，适口性更好，既有利于动物的主动采食，又有利于动物的消化吸收，较其他秸秆更加适用于饲料生产。此外，Carlson等研究发现，藜麦粗糠中的皂苷种类丰富，且对调控瘤胃微生物发酵、提高氮存留率和抑制瘤胃甲烷(CH)产量有益，可用作动物绿色饲料。因此，将藜麦秸秆进行加工后开发为饲料，有望成为未来藜麦秸秆开发利用的主要研究方向和实现藜麦秸秆资源化利用的主要手段。

近年来，有关藜麦秸秆的研究日益增多。陈光等对藜麦全植株的综合利用和开发前景进行了综述，认为藜麦全株皆有利用价值，均能产生一定的经济效益。张慧玲研究了不同处理下汽爆发酵对藜麦秸秆成分组成、纤维结构和风味的影响。魏玉明等研究了不同添加剂对藜麦秸秆青贮后综合品质的影响。此外，还有研究表明，益生菌能够有效提高黄贮秸秆的营养价值。例如：利用裂褶菌、酵母菌作为发酵微生物，可以提高玉米秸秆黄贮发酵的品质；经过纤维素酶、木聚糖酶和黄孢原毛平革菌混合发酵后，黄贮玉米秸秆的纤维素含量显著降低。黄贮饲料全年均可生产，通过乳酸菌对黄贮玉米秸秆进行发酵，既可改善其饲喂价值，又能同时解决北方地区农作物收获期与青贮饲料生产时间相悖的问题。由此推测，如能利用微生物对大量藜麦秸秆进行发酵处理，有望提高藜麦秸秆的利用效率。然而，有关藜麦秸秆的微生物发酵条件在本研究检索范围内还鲜见报道。为此，本研究特以乳酸菌为发酵微生物，基于Box-Behnken设计原理优化藜麦秸秆的发酵工艺，并测定不同条件下发酵后藜麦秸秆的粗蛋白质含量，以期为开发藜麦秸秆黄贮饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藜麦秸秆取自甘肃省兰州市榆中县夏官营镇。秸秆收获后，放置风干至黄贮，在无菌操作台上将其切碎为小段，每段长度为2 cm。同时，测定其含水量和粗蛋白质含量。

发酵所用菌种为市售壮乐美牌乳酸杆菌(粉剂)。

主要仪器包括：海能K9840型自动凯式定氮仪，山东海能科学仪器有限公司；鸿奕101-2A型电热鼓风干燥箱，山东屹盛重工科技有限公司；PH-010型烘干培养两用箱，上海一恒科学仪器有限公司；拜杰QH-1688型真空包装机，浙江德清拜杰厨卫科技有限公司；比朗BILON-DFY-400C型小型粉碎机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 单因素试验设计

1.2.1 秸秆发酵时间对藜麦秸秆感官品质和粗蛋白质含量的影响

在避光真空密闭的条件下，控制秸秆含水量为60%、乳酸菌添加量为10 mg·kg、发酵温度为30 ℃，分别设定发酵时间为5、10、15、20、25、30 d。发酵完毕后，进行感官品质评定，并取样2 g测定粗蛋白质含量。

1.2.2 乳酸菌添加量对藜麦秸秆感官品质和粗蛋白质含量的影响

在避光真空密闭的条件下，控制发酵时间为25 d、发酵温度为30 ℃、秸秆含水量为60%，分别设定乳酸菌添加量为2、4、6、8、10、12 mg·kg。发酵完毕后，进行感官品质评定，并取样2 g测定粗蛋白质含量。

1.2.3 秸秆含水量对藜麦秸秆感官品质和粗蛋白质含量的影响

在避光真空密闭的条件下，控制发酵时间为25 d、发酵温度为30℃、乳酸菌添加量为10 mg·kg，分别设定秸秆含水量为20%、30%、40%、50%、60%、70%。发酵完毕后，进行感官品质评定，并取样2 g测定粗蛋白质含量。

1.3 响应面法优化试验设计

根据Box-Behnken设计原理，在单因素试验的基础上，选取对藜麦秸秆黄贮饲料粗蛋白质含量有显著影响的发酵时间、乳酸菌添加量、秸秆含水量3个因素作为自变量，以发酵后黄贮饲料的粗蛋白质含量为响应值，进行3因素3水平的响应面分析试验，优化藜麦秸秆发酵工艺。

1.4 指标测定

1.4.1 藜麦秸秆发酵饲料感官评定

当藜麦秸秆发酵完成后，开启黄贮袋，根据《青贮饲料质量评定标准(试行)》，从气味、色泽、质地、pH值4方面进行感官评定。按照其分值，分别评为优良、良好、一般和劣质。

1.4.2 藜麦秸秆粗蛋白质含量测定

精确称取2 g样品(准确至0.000 1 g)，将样品磨碎至粉末状，置于消化管中，加硫酸铜0.8 g、无水硫酸钾12 g，混合均匀，加入浓硫酸40 mL和碎瓷片1～2片，放置在电热炉上加热，待内容物全部炭化、停止冒泡后，加大火力，至变为透明深蓝色溶液，继续加热2 h，取下，放置至冷却。使用自动凯式定氮仪测定粗蛋白质含量。

1.5 数据处理

每组试验做3次平行，结果取平均值。采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析。采用Design-Expert 10.0软件进行响应面设计与结果分析。采用Sigma plot 14.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 藜麦秸秆的营养成分分析

发酵之前，经测定，试验用的藜麦秸秆的粗蛋白质含量为6.36%。查阅相关文献可知，藜麦秸秆中还含有较为丰富的纤维素(33.88%)、半纤维素(20.32%)和木质素(18.18%)，以及一定的粗脂肪(2.52%)。与玉米秸秆粗蛋白质含量6.14%、粗脂肪含量1.97%、半纤维素含量17.38%、木质素含量27.81%、纤维素含量32.28%相比，藜麦秸秆的粗蛋白质、粗脂肪、纤维素、半纤维素含量均更高，而木质素含量更低，推测其更适于反刍动物的消化和吸收。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 发酵时间对发酵后藜麦秸秆感官品质和粗蛋白质含量的影响

当发酵时间≤15 d时，发酵后的藜麦秸秆的pH值均高于4，说明发酵时间尚短，乳酸菌还不能充分地氧化代谢，秸秆的感官品质难以得到很好的改善(表1)。当发酵时间为20～30 d时，感官评定等级最高，样品变得松散软糯，质地得到改善。

表1 不同发酵时间下发酵后藜麦秸秆的感官评定结果

随发酵时间延长，发酵后的藜麦秸秆的粗蛋白质含量呈现先升后降的趋势(图1)。当发酵时间为20～30 d时，发酵后藜麦秸秆的粗蛋白质含量较为稳定。当发酵时间为25 d时，发酵后藜麦秸秆的粗蛋白质含量显著(<0.05)高于未发酵的秸秆。

图1 发酵时间对秸秆粗蛋白含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on crude protein content of straw

结合单因素试验结果，在Box-Behnken中心组试验设计中，将发酵时间设定为20～30 d。

2.2.2 乳酸菌添加量对发酵后藜麦秸秆感官品质和粗蛋白质含量的影响

当乳酸菌添加量为10～12 mg·kg时，发酵后的藜麦秸秆的pH值均在4.0以下，气味为甘酸味，秸秆脉络清晰且松散软糯，色泽明亮鲜黄，感官评定等级最高，均为优良(表2)。

表2 不同乳酸菌添加量下发酵后藜麦秸秆的感官评定结果

发酵后藜麦秸秆的粗蛋白质含量随着乳酸菌添加量的增加而增加(图2)。当乳酸菌添加量为2～4 mg·kg时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量较低。这可能是由于乳酸菌添加量过少，发酵效果较弱。当乳酸菌添加量为8～12 mg·kg时，发酵后的藜麦秸秆的粗蛋白质含量较未发酵秸秆明显增加，其中，当乳酸菌添加量为12 mg·kg时，发酵后的藜麦秸秆的粗蛋白质含量最高。

图2 乳酸菌添加量对秸秆粗蛋白含量的影响Fig.2 Effect of addition amount of lactic acid bacteria on crude protein content of straw

结合单因素试验结果，在Box-Behnken中心组试验设计中，将乳酸菌添加量设定为8～12 mg·kg。

2.2.3 秸秆含水量对发酵后藜麦秸秆感官品质和粗蛋白质含量的影响

当秸秆含水量为50%～60%时，发酵后的藜麦秸秆的感官评定等级最高，均为优良(表3)。对比发现，秸秆含水量过高或过低均会使发酵秸秆的感官评定结果变差。当秸秆含水量≥70%时，会引起秸秆酸败，气味酸臭刺鼻，秸秆质地黏连结块；当秸秆含水量<40%时，乳酸菌不能很好地氧化代谢，秸秆品质难以得到充分改善，pH值过高，颜色为暗黄色，质地略硬，感官评定等级一般。

表3 不同秸秆含水量下发酵后藜麦秸秆的感官评定结果

当秸秆含水量低于50%时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量较低(图3)。这可能是由于秸秆含水量过低，营养物质大量损耗造成的。当秸秆含水量为50%～70%时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量较为稳定。当秸秆含水量为60%时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量最高。

图3 秸秆含水量对秸秆粗蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of water content of straw on crude protein content of straw

结合单因素试验结果，在Box-Behnken中心组试验设计中，将秸秆含水量设定为50%～70%。

2.3 响应面设计结果与分析

为进一步研究各因素之间的交互作用，利用Design-Expert 10.0软件，以发酵时间()、乳酸菌添加量()、秸秆含水量()为自变量，以发酵后的藜麦秸秆的粗蛋白质含量为响应值()，进行3因素3水平的响应面设计(表4)，开展试验(表5)，并进行相应的数据分析。

表4 响应面试验的因素及其水平

表5 响应面试验方案与结果

经多元回归分析，得到如下拟合方程：

=6.646+6.625×10+0.410+0.141-1.175×10-0155-1.750×10-0388-1.705×10-0.463。

对拟合的回归方程进行方差分析，结果显示，模型通过<0.05水平的显著性检验，说明该模型具有统计学意义。基于值判断，各因素对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响从大到小依次为>>，即乳酸菌添加量>秸秆含水量>发酵时间。拟合的回归方程的决定系数()为0.991 9，校正决定系数为0.981 5，说明其与真实数据的拟合程度良好，具有实践指导意义，可以用该拟合方程来指导藜麦秸秆发酵工艺优化。

发酵时间和乳酸菌添加量的交互作用对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响呈拱形曲面分布，纵向跨度较大，且等高线呈现椭圆形(图4)，表明二者的交互作用对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量影响显著。当发酵时间一定时，随着乳酸菌添加量的增加，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量呈递增趋势；当乳酸菌添加量一定时，随着发酵时间延长，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量呈现先增加后减小的趋势。相较而言，乳酸菌添加量方向的曲面出现较大幅度的波动，表明相较于发酵时间，乳酸菌添加量对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响更大。

图4 发酵时间(A)和乳酸菌添加量(B)的交互作用对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响Fig.4 Effect of interaction between fermentation time (A) and addition amount of lactic acid bacteria (B) on crude protein content of fermented straw

发酵时间和秸秆含水量的交互作用对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响呈抛物曲面分布(图5)，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量随发酵时间和秸秆含水量的增加均呈现先增后减变化。在这二者的交互作用中，秸秆含水量对粗蛋白质含量的影响相较于发酵时间更大。

图5 发酵时间(A)和秸秆含水量(C)的交互作用对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响Fig.5 Effect of interaction between fermentation time (A) and water content of straw (C) on crude protein content of fermented straw

秸秆含水量和乳酸菌添加量的交互作用对粗蛋白质含量的影响呈拱形曲面分布(图6)。二者中，乳酸菌添加量是更为敏感的影响因子，引起曲面波动较大。

图6 乳酸菌添加量(B)和秸秆含水量(C)的交互作用对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响Fig.6 Effect of interaction between addition amount of lactic acid bacteria (B) and water content of straw (C) on crude protein content of fermented straw

以发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量最大为优化目标，利用Design-Expert 10.0软件求取全局最优解，结果表明，最优工艺为发酵时间24.594 d，乳酸菌添加量11.775 mg·kg，秸秆含水量59.813%。在此条件下，预测的发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量为6.873%。

根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，将发酵工艺调整为发酵时间24.5 d，乳酸菌添加量12 mg·kg，秸秆含水量60%。在此条件下进行3次验证试验，测得发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量为(6.93±0.05)%，与预测结果接近，表明本研究所采用的方法有效且可行。

3 讨论

3.1 不同发酵条件对藜麦秸秆感官品质和pH值的影响

相关研究表明，饲草表面附着的乳酸菌在很多条件下难以很好地启动发酵进程，需要通过外源添加乳酸菌来加速发酵过程，降低pH值，并抑制不良微生物的繁殖。乳酸菌利用植物中的可溶性碳水化合物作为底物，产生乳酸，降低发酵饲料的pH值。本研究利用乳酸菌对藜麦秸秆进行发酵后，未产生腐败的迹象，且秸秆脉络清晰，颜色为亮黄色，质地松散软糯，酸味适中，pH值在3.5～5.0。这说明，适当地使用乳酸菌可以在很大程度上保证发酵的成功。一般来说，乳酸菌能快速降低秸秆pH值，增加有机酸含量，且以使秸秆pH值降到4.2以下为最佳。根据本研究结果，当发酵时间为20～30 d、乳酸菌添加量为10～12 mg·kg、秸秆含水量为50%～60%时，发酵秸秆的pH值可以保持在4.0及以下，感官评定等级较高。

3.2 发酵时间对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响

本研究中，当藜麦秸秆的发酵时间为20～30 d时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量较为稳定，且较发酵前略有增加。根据代素贞等的研究，添加乳酸菌可减少蛋白质的损失，同时可产生菌体蛋白。添加微生物菌剂能有效缩短发酵时间，增加秸秆堆体内的微生物数量，促进发酵进程。发酵时间过短时，乳酸菌利用秸秆的干物质进行代谢繁殖，但产生的菌体蛋白还未累积，可能受此影响，本试验5～15 d内发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量并未显著提高。发酵时间过长也不利于提高秸秆品质。这是因为，适宜的可溶性碳水化合物是黄贮发酵的前提，随着发酵时间延长，pH值降低，以及可溶性碳水化合物的减少都将抑制乳酸菌的生长繁殖。这可能是导致发酵30 d的藜麦秸秆粗蛋白质含量略低于发酵25 d时的原因之一。

3.3 乳酸菌添加量对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响

乳酸菌属革兰氏阳性菌，厌氧呼吸，不形成孢子，具有耐酸和附生的特性。大多数乳酸菌最适于代谢繁殖的温度为30 ℃。为此，本研究也将乳酸菌发酵藜麦秸秆的温度设定为30 ℃。在发酵过程中，藜麦秸秆的水溶性碳水化合物和干物质可以为乳酸菌的生长提供营养物质，从而促进乳酸菌的增殖。此外，发酵时适当地添加乳酸菌也可以起到抑制有害微生物生长活性、提高秸秆营养成分和改善秸秆纤维结构的作用，且可以有效降低秸秆发酵中营养成分的损失，提高发酵品质。本研究结果显示，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量随着乳酸菌添加量的增加而增加，说明添加乳酸菌可改善发酵过程中的微生态系统，使益生菌成为主要优势菌群，产生营养物质，为其他微生物发酵提供充足底物，快速增加有机酸的种类和含量，降低体系pH值和氨态氮含量，进而提高黄贮秸秆的发酵品质。本研究结果与向玉米秸秆黄贮和玉米秸秆青贮中添加乳酸菌的研究相似，适量添加乳酸菌均提高了秸秆表面乳酸菌的数量，使其能够利用秸秆中的可溶性糖，迅速降低pH值，增加粗蛋白质含量，从而有效提高发酵品质。

3.4 秸秆含水量对发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量的影响

前人研究表明，用乳酸菌发酵玉米黄贮秸秆时，将水分控制在60%时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量最高，酸性洗涤纤维含量最低，玉米秸秆黄贮的发酵品质最好。本研究同样发现，当秸秆含水量为60%时，发酵后的藜麦秸秆感官等级最佳，且粗蛋白质含量最高。这与玉米黄贮秸秆发酵结果基本吻合，也进一步验证了该秸秆含水量条件下进行发酵的可行性。原料含水量易影响乳酸菌的代谢繁殖活性，进而影响黄贮秸秆的营养成分和发酵品质。在本研究中，当秸秆含水量低于50%时，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量较低，其原因可能是秸秆含水量过低时乳酸菌活性较弱。而且，秸秆含水量低时，不易压实，也容易致使其他微生物成为优势菌，从而造成霉败。当秸秆含水量升高到70%后，发酵后的藜麦秸秆粗蛋白质含量降低。这可能是由于含水量过高导致秸秆营养物质渗出，从而引起营养成分损失。此外，高含水量环境还不利于乳酸菌的生长，会导致乳酸发酵不足，生成一些不稳定的产物，使得乳酸含量较低，pH值下降较慢。另外，含水量过低时，乳酸菌活性差，发酵效果甚微，发酵感不明显。综合前人研究和本试验结果，秸秆含水量过高或过低都不利于黄贮秸秆发酵，以秸秆含水量保持在60%左右最佳。在此条件下，既可使可溶性碳水化合物等养分浓缩，有利于乳酸菌发酵，又能保证乳酸菌代谢繁殖活性，提高黄贮秸秆品质。

3.5 响应面法在藜麦秸秆发酵工艺优化中的作用

响应面法通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，并对受多个变量影响的响应值进行建模和分析，可用于寻求最优工艺参数。该方法在畜禽日粮营养分析、固态发酵饲料等方面均已得到一定的应用。本研究使用响应面法对藜麦秸秆黄贮发酵工艺进行优化，相较于正交试验来说，试验组少，对试验的各个水平可快速分析，并能够获得连续的预测模型。经响应面法优化的藜麦秸秆乳酸菌发酵工艺，可以为后续藜麦秸秆发酵饲料的研发奠定一定的工艺基础。