田 锐*， 高 闯， 党珍珍， 孙雪花， 马红燕

(延安大学化学与化工学院，延安市分析技术与检测重点实验室，陕西延安 716000)

SiO2纳米粒子由于其良好的光学特性、稳定性、生物相容性及易于功能化等特征在分析领域备受关注[1,2]。基于荧光SiO2纳米粒子的荧光分析法在分析检测、生物成像等领域得到了广泛应用[3 - 6]。苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)是一种有毒的硝基酚类化合物，该化合物在染料、炸药、烟花、玻璃、医药杀菌剂、皮革工业以及农业等方面有着广泛应用[7 - 9]。但排放于环境中的苦味酸会对环境造成污染，对人的皮肤、眼睛、呼吸道等产生毒害作用，还会损伤肝脏和肾脏、引起慢性中毒等[10,11]。因此，对环境中苦味酸的检测具有十分重要的意义。目前已经报道的检测苦味酸的方法主要有：高效液相色谱法[12]、液-质联用法[13]、气-质联用法[14]、拉曼光谱法[15]、电化学法[16]、荧光分析法[17]等。荧光检测法具有灵敏度高、稳定性好、分析速度快、实验费用低等优点，在分析检测中得到广泛应用，研究检测苦味酸的荧光探针也具有重要意义。

实验发现，苦味酸对组装于壳聚糖(CS)/SiO2纳米粒子上的罗丹明B(RhB)的荧光有较强的猝灭作用。据此，实验制备了RhB/CS/SiO2纳米粒子，利用苦味酸对RhB/CS/SiO2纳米粒子的荧光猝灭作用，建立了一种灵敏、简便、经济的检测苦味酸的荧光分析新方法，并将其用于水样中苦味酸的检测。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

荧光分光光度计(F-2700，日本日立科学仪器有限公司)；瞬态稳态荧光光谱仪(FLSP920，英国爱丁堡公司)；紫外-可见吸收光谱仪(8453，美国安捷伦公司)；离心机(H1850，湘仪离心机有限公司)；多点磁力搅拌器(RO10，德国IKA公司)；电子天平(BSA224S-CW，德国赛多利斯公司)。

苦味酸(PA)(分析纯，西亚试剂有限公司)；罗丹明B(RhB)(分析纯，西安化学试剂厂)；Triton X-100、正硅酸乙酯、壳聚糖(CS)(分析纯，Sigma公司)。其他所用的常见试剂如正己醇、环已烷、丙酮等均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 纳米粒子的制备

参考文献方法[18]，采用反相微乳液法，以壳聚糖(Chitosan，CS)为模板，正硅酸乙酯为硅源制备纳米粒子。具体步骤为：合成瓶中加入1.8 mL Triton X-100、1.8 mL正己醇和7.5 mL环己烷，混合均匀后，加入150 μL的超纯水搅拌30 min，然后加入100 μL CS溶液搅拌1 h，之后缓慢加入NaOH溶液调节体系pH值至中性，最后加入80 μL的正硅酸乙酯和60 μL氨水，室温搅拌水解24 h。反应完成后破乳、离心、洗涤，得产物CS/SiO2纳米粒子。

将等体积的1.0×10-3mol/L RhB溶液与上述制备的CS/SiO2纳米粒子分散液混合后，振荡组装30 min 后离心、洗涤得RhB/CS/SiO2纳米粒子。

1.3 实验方法

取0.20 mL RhB/CS/SiO2纳米粒子分散液于比色管中，加入0.30 mL B-R缓冲溶液(pH=11.0)，再加入一定量的苦味酸溶液，最后用超纯水稀释至总体积为2.00 mL。反应50 min后，在荧光分光光度计上测定样品组(F)和对照组(F0)的荧光信号值，根据ΔF(ΔF=F0-F)与苦味酸浓度的关系定量测定苦味酸含量。

2 结果与讨论

2.1 纳米粒子的表征

对制备的纳米粒子进行了透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱表征(图1)。从图1A中可以看出，CS/SiO2纳米粒子为具有疏松多孔结构、粒径60 nm左右的球型；图1B红外光谱图显示，CS/SiO2纳米粒子同时具有SiO2和CS的特征吸收峰，表明CS被复合进了纳米粒子中。

图1 Chitosan/SiO2纳米粒子的透射电镜(TEM)图(A)和傅里叶变换红外(FTIR)光谱图(B)Fig.1 TEM image(A) and FTIR spectra(B) of Chitosan/SiO2 nanoparticles

2.2 光谱及传感性质

分别测定RhB、RhB/CS/SiO2及RhB/CS/SiO2-PA的荧光发射光谱(图2)，图中各曲线发射峰位置一致，说明CS/SiO2及苦味酸都不会影响RhB的发射性质，但是通过比较加入苦味酸前后(曲线b、c)发射峰的强度，发现苦味酸加入后体系的荧光信号明显降低，这是由于苦味酸对RhB的荧光产生了猝灭作用。

图2 荧光光谱图(a.罗丹明B；b.RhB/Chitosan/SiO2；c.RhB/Chitosan/SiO2-PA)Fig.2 Fluorescence spectra(a.RhB;b.RhB/Chitosan/SiO2;c.RhB/Chitosan/SiO2-PA)

为了考察RhB/CS/SiO2纳米粒子的传感性能，实验比较了苦味酸对RhB、RhB/SiO2和RhB/CS/SiO2纳米粒子的荧光猝灭情况，结果表明相同条件下苦味酸对RhB/CS/SiO2荧光纳米粒子的荧光猝灭程度最大(图3)。这可能是由于CS的制孔作用使CS/SiO2纳米粒子具有孔结构[19]，增大了CS/SiO2纳米粒子的比表面积和RhB组装量，同时也得使苦味酸更容易扩散进入纳米粒子内与RhB分子作用使其荧光猝灭，而由于纳米粒子微环境中RhB分子彼此间距离较小，形成信号放大效应[20]。实验同时还对CS用量、RhB用量及组装时间进行了考察。结果表明，在合成时加入100 μL 0.1%的CS所制备的CS/SiO2纳米粒子对RhB的组装和苦味酸的传感性能最好，具体为CS/SiO2纳米粒子分散液与等体积1.0×10-3mol/L RhB振荡组装30 min时，所得RhB/CS/SiO2纳米粒子的传感灵敏度最高。

图3 罗丹明B、RhB/SiO2和RhB/Chitosan/SiO2的传感性能比较Fig.3 Fluorescence sensing performance of RhB,RhB/SiO2 and RhB/Chitosan/SiO2

2.3 荧光寿命与吸收光谱

为了探讨苦味酸对RhB/CS/SiO2纳米粒子的荧光猝灭作用，实验测定了加入苦味酸前后RhB/CS/SiO2荧光纳米粒子的荧光寿命。实验表明RhB/CS/SiO2荧光纳米粒子的荧光寿命没有发生变化(图4)，说明苦味酸对RhB/CS/SiO2荧光纳米粒子的猝灭为静态猝灭[21]，这与紫外-可见吸收光谱(图5)结果一致。

图4 RhB/Chitosan/SiO2溶液加入PA前后的荧光寿命曲线Fig.4 Time -resolved fluorescence decay curve of RhB/Chitosan/SiO2 in the presence and absence of PA

图5 苦味酸、RhB/Chitoasan/SiO2和RhB/Chitosan/SiO2-PA的UV-Vis吸收光谱Fig.5 UV-Vis absorption spectra of PA、RhB/Chitoasan/SiO2 and RhB/Chitosan/SiO2-PA

2.4 实验条件的优化

2.4.1 pH的影响在pH为2.0～12.0范围内(B-R缓冲溶液)，考察了pH对测定的影响。结果表明，当体系pH为11.0时ΔF最大(图6)。这可能是由于在碱性条件下苦味酸会被去质子化，从而促进了它与RhB的结合，但是如果碱性太强，RhB也会产生去质子化，导致其从纳米粒子上脱落，故实验确定pH为11.0。

图6 pH对体系的影响Fig.6 Effect of pH on the system

2.4.2 缓冲液用量及反应时间的影响实验考察了B-R缓冲溶液用量对测定灵敏度的影响。结果表明，缓冲液用量为0.30 mL时ΔF值最大，故实验确定缓冲液用量为0.30 mL。

室温下，苦味酸和RhB/CS/SiO2荧光纳米粒子作用时间的长短直接影响检测灵敏度。因此，考察了作用时间对RhB/CS/SiO2荧光猝灭的影响。结果表明，RhB/CS/SiO2荧光纳米粒子与苦味酸作用50 min后ΔF基本不变，因此实验选择时间为50 min。

图7 有机化合物对体系荧光猝灭程度的影响Fig.7 Effect of organic compounds on fluorescence quenching efficiency of the system

2.5 标准曲线

在优化实验条件下对苦味酸进行测定，结果表明，在5.0×10-6～6.0×10-4mol/L浓度范围内，体系的ΔF与苦味酸浓度呈良好线性，线性方程为：ΔF=3.41×106c+465.84，相关系数r=0.9990，检出限为3.0×10-6mol/L。方法相对标准偏差(RSD)为0.21%(cPA=1.0×10-5mol·L-1，n=11)。

2.6 样品分析

向未检出苦味酸的水样中，加入一定量的苦味酸溶液测定回收率，检测到的苦味酸浓度与加入浓度基本一致，表明方法可以用于水样中苦味酸的检测。

表1 样品中苦味酸测定结果

3 结论

本文采用反相微乳液法，以壳聚糖(CS)为模板合成了CS/SiO2纳米粒子，通过振荡吸附将罗丹明B(RhB)组装在其上得RhB/CS/SiO2纳米粒子。利用苦味酸对RhB/CS/SiO2纳米粒子的荧光猝灭作用，建立了测定苦味酸的荧光分析新方法。该方法具有很好的灵敏度和选择性，可用于环境水体中苦味酸的分析检测。