张顺润， 郑 霄， 刘晓军,2,3， 朱春楠,2,3， 刘 超,2,3， 张朱珊莹,2,3， 郑冬云*,2,3

(1.中南民族大学生物医学工程学院，湖北武汉 430074；2.医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，湖北武汉 430074；3.脑认知科学实验室国家民委重点实验室，湖北武汉 430074)

自1992年被美国《Science》杂志评为“年度明星分子”后[1]，NO的重要生理功能逐渐为大众所认识[2,3]。研究表明，许多疾病的发生，如冠心病、肿瘤、胃肠炎、哮喘等，均与机体内NO含量异常有关。因此，生物样品中NO含量的准确实时检测具有非常重要的生物医学意义。然而，NO半衰期短[4]、浓度低、共存干扰物质多，给这项任务带来了巨大挑战。在NO的众多检测方法中，电化学传感方法因具有灵敏度高、响应快速、抗干扰能力好和无需样品预处理等特点而得到广泛关注。在NO电化学传感界面的构建过程中，化学修饰电极起着关键作用[5]。因此，根据检测对象的特征，选择合适的敏感材料及固定化方法显得尤为重要。

作为一种新型碳纳米材料，石墨烯具有独特的二维蜂窝结构和sp2杂化晶体结构，内部存在的大量离域电子使其拥有非凡的导电能力，此外石墨烯还具有比表面积大、生物相容性好等优点，是一种理想的电极修饰材料[6 - 8]。另一方面，有机染料导电聚合膜修饰电极具有稳定性好、催化性能高、选择性强等优点，已经在电化学传感领域显示出良好的应用前景[9 - 11]。比如，可通过电化学聚合的方法将溴甲酚绿修饰到电极表面，并应用于电化学传感领域[12]。作为一种氧化还原导电聚合物，聚溴甲酚绿(PBG)[13,14]具有良好的电催化性能、快速的电荷转移能力以及离子传输能力。本工作制备出Nafion-聚溴甲酚绿-石墨烯纳米复合膜，实现了其在玻碳电极(GCE)表面的修饰固定，从而构建了一种新型的NO纳米传感界面。对纳米复合膜进行了微观形貌和电化学行为表征，并探讨了该纳米复合膜对NO的电催化性能，对传感器的各项分析性能进行了评价。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电化学实验均在CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)上完成。扫描电镜(SEM)表征在场发射电镜-SU8010(日本日立)上进行。pHS-3E酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司)用于调节溶液pH值。PGUV-10-AS超纯水仪(武汉品冠仪器设备有限公司)用于实验用超纯水的制备。

氧化石墨烯(GO)分散液(1 mg/mL)购自苏州碳丰石墨烯科技有限公司。L-精氨酸购自上海如吉生物科技发展有限公司。5%的Nafion溶液购自上海楚兮实业有限公司，使用时用超纯水稀释至0.05%。多巴胺(DA)、抗坏血酸(AA)和尿酸(UA)购自Fluka。溴甲酚绿、无水乙醇、Na2CO3、KClO4、NaOH、HCl、HNO3、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、K4[Fe(CN)6]和K3[Fe(CN)6]均购自国药集团化学试剂有限公司。高纯氮气和高纯NO气体纯度为99.999%，购自武汉纽瑞德特种气体有限公司。其中，高纯氮气用于除去NO测试溶液中的氧气，高纯NO气体用于制备NO饱和溶液。NO饱和溶液及标准溶液的制备依据参考文献方法[6]制备。其它试剂均为分析纯。

浓度为1.0×107/mL的豚鼠肝细胞溶液来自中南民族大学生命科学学院。

1.2 纳米复合膜修饰玻碳电极的制备

Nafion/PBG/GO/GCE的制备步骤：(1)先用抛光布和粒径50 nm Al2O3浆液将直径3 mm的GCE抛光至镜面，然后依次用体积比为1∶1的HNO3、无水乙醇和超纯水各超声清洗2 min，室温晾干。(2)将裸GCE置于0.1 mol/L的KClO4+Na2CO3测试溶液中，采用循环伏安法，在-0.2～2.0 V电位范围内，以50 mV/s的扫描速率环扫5圈，对该电极进行电化学活化。(3)在活化GCE表面滴涂5 μL 1 mg/mL的GO分散液，红外灯下烘干，制得GO/GCE。(4)将GO/GCE置于含有1.0×10-3mol/L溴甲酚绿的0.5 mol/L NaNO3溶液中，以50 mV/s的扫描速率，在1.0～1.8 V的电位范围内，循环伏安扫描20圈，对溴甲酚绿进行电化学聚合，制备得到PBG/GO/GCE。(5)将PBG/GO/GCE置于0.05%的Nafion溶液中，在-1.6～1.6 V的电位范围内，以50 mV/s的扫描速率循环伏安扫描10圈，制得Nafion/PBG/GO/GCE，即NO电化学传感器。

1.3 NO的电化学检测

检测体系均采用三电极系统：GCE或修饰GCE为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂电极为对电极。测试溶液为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0)，扫描电位为0.3～1.1 V。

2 结果与讨论

2.1 不同电极的扫描电镜表征

采用扫描电镜技术对不同电极的表面形貌进行了表征。由图1A可见，裸GCE的表面光滑平整；在GO/GCE表面，可明显观察到一层GO薄膜(图1B)；PBG在GCE表面呈褶皱状薄膜状态(图1C)，而PBG/GO/GCE的表面褶皱更加明显，呈沟壑状(图1D)，该结构对提高修饰电极的有效比表面积非常有利，有助于NO在电极表面的富集，从而提高NO电化学传感器的灵敏度。

图1 裸GCE(A)、GO/GCE(B)、PBG/GCE(C)以及PBG/GO/GCE(D)的扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM images of bare GCE(A),GO/GCE(B),PBG/GCE(C) and PBG/GO/GCE(D)

2.2 NO在不同电极上的电化学响应

采用差分脉冲伏安法(DPV)研究了2.25×10-5mol/L NO在不同电极上的电化学响应。测试溶液中没有NO时，无明显的电化学响应信号(图2a)；存在NO时，裸GCE在0.79 V出现了一个很微弱的电化学信号，峰电流约为0.23 μA(图2b)；在GO/GCE上，NO的电化学响应有所改善，峰电位负移，峰电流增大至0.83 μA(图2c)；NO在PBG/GCE上的电化学响应改善更加明显，氧化峰电流增大至1.1 μA(图2d)；相较于其他电极，NO在PBG/GO/GCE上的电化学响应最为灵敏，峰形尖锐，峰电位为0.71 V，峰电流为5.5 μA(图2e)。结果表明，PBG/GO纳米复合膜对NO的电化学氧化具有明显催化作用，这归功于PBG和GO的协同作用。GO具有较大的比表面积，有助于提高NO在电极表面的富集量；同时，GO还具有良好的导电性，可有效促进NO与电极之间的电子传递；而导电聚合物PBG则可作为电子媒介体在NO的电化学氧化过程中发挥催化作用。

图2 PBG/GO/GCE(a和e)、裸GCE(b)、GO/GCE(c),以及PBG/GCE(d)在含有(b,c,d和e)及未含有(a)2.25×10-5 mol/L NO的0.1 mol/L除氧PBS(pH=7.0)中的差分脉冲伏安图Fig.2 Differential pulse voltammograms of PBG/GO/GCE (a and e),bare GCE(b),GO/GCE (c) and PBG/GCE (d) in 0.1 mol/L deoxidized PBS solution(pH=7.0) with (b,c,d and e) and without (a) 2.25×10-5 mol/L NO

2.3 NO传感机理探讨

采用线性扫描伏安法研究了NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的电化学行为。如图3A所示，当扫描速率v从50 mV/s逐渐增加至250 mV/s时，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的氧化峰电流呈线性增大：Ip=2.4+0.034v，R2=0.9800(图3B)，表明NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的电化学氧化反应是一个受吸附控制的过程。同时，循环伏安结果显示，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的电化学氧化是一个完全不可逆的反应。对于一个受吸附控制的完全不可逆反应，峰电位与扫描速率的自然对数呈线性相关[15]。结合图3C中的数据处理结果，即：Ep=0.61+0.06lnv(R2=0.9900)，根据Laviron theory公式[15]，可计算得到，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上所发生的电化学氧化反应中，转移电子数为0.7≈1。

图3 (A)不同扫描速率下2.25×10-5 mol/L NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的线性扫描伏安图；(B)NO氧化峰电流与扫描速率之间的线性关系图；(C)NO氧化峰电位与扫描速率自然对数之间的线性关系图Fig.3 (A)Linear sweep voltammoams of 2.25×10-5 mol/L NO on Nafion/PBG/GO/GCE at different scan rates;(B)Linear relationship between the oxidation peak current of NO and scan rates;(C)Linear relationship of the oxidation peak potential of NO with the natural logarithm of scan rates

2.4 传感器的性能评价及实际应用

2.4.1 传感器的线性范围、灵敏度、检出限及响应时间采用安培法对所制备NO电化学传感器的分析性能进行了评价，如图4所示。从200 s开始，每隔100 s，向测试溶液中加入不同浓度NO标准溶液。可以看出在200～700 s，由于NO浓度较低，未观察到明显的NO电化学响应；700 s后，随NO浓度的增加，开始出现电流阶梯，对应于NO在电极表面的电化学氧化(图4A)。对图4A中的数据进行处理可得，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的氧化峰电流与其浓度在1.0×10-7～2.25×10-4mol/L范围内呈良好线性关系(图4B)。其线性范围分别为：1.0×10-7～1.0×10-6mol/L和1.0×10-6～2.25×10-4mol/L，灵敏度分别为4.16 μA/(μmol/L)和0.44 μA/(μmol/L)。结合图4B的内插图，采用作图法可得到传感器的检出限为2.0×10-8mol/L。

图4 (A)0.1 mol/L的除氧PBS(pH=7.0)中不同浓度的NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的安培响应;(B)NO氧化峰电流与其浓度间的线性关系图Fig.4 (A)Amperometric response of Nafion/PBG/GO/GCE with successive injections of NO in 0.1 mol/L deoxidized PBS solution(pH=7.0)(Inset:amperometric response of 100 nmol/L NO);(B)Relationship between the oxidation peak current of NO and its concentration(Inset:the concentration range is from 1.0×10-7 mol/L to 1.0×10-6 mol/L)

2.4.2 传感器稳定性、重现性和抗干扰能力稳定性和重现性也是电化学传感器的重要性能指标。将制备好的Nafion/PBG/GO/GCE在空气中放置15 d后，用于2.25×10-5mol/L NO的测定，其响应信号为原来的92%，表明传感器具有良好的稳定性。用同一支Nafion/PBG/GO/GCE对2.25×10-5mol/L NO进行10次平行测定，NO氧化峰电流的相对标准偏差为4.6%，表明传感器具有良好的重现性。

图5 生物共存物质对NO电化学响应的影响Fig.5 Influence of biological coexisting substance on the electrochemical response of NO

2.4.3 传感器的实际应用取两份等体积的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)，均通氮气除氧10 min，向其中一份溶液中加入一定体积的豚鼠肝细胞溶液(1.0×107/mL)，另外一份不加入。然后将Nafion/PBG/GO/GCE分别置于上述溶液中，设置检测电位为0.85 V进行测试。在200 s时，分别向两份溶液中加入50 μL浓度为0.1 mol/L的L-精氨酸(L-Arg)，结果如图6所示。由图可看出，当测试溶液中没有豚鼠肝细胞时，即使在L-Arg的刺激下，也未见明显的电化学响应(图6b)；而当测试溶液中含有豚鼠肝细胞时，在L-Arg的刺激下，豚鼠肝细胞中的一氧化氮合酶会以L-Arg为底物，催化合成NO[17]，因此可观察到属于NO的明显阶梯状电流信号(图6a)。结果表明，所构建的NO电化学传感器可应用于生物样品中NO含量的准确实时检测。

图6 以0.1 mol/L除氧的PBS(pH=7.0)为测试溶液，传感器分别在含有豚鼠肝细胞(a)和不含豚鼠肝细胞(b)溶液中的安培响应图Fig.6 Amperometric response of the sensor in 0.1 mol/L deoxidized PBS (pH=7.0) with guinea pig hepatocyte(a) and without guinea pig hepatocyte(b)

3 结论

构建了Nafion-聚溴甲酚绿-石墨烯纳米复合膜修饰玻碳电极，从而构建了一种性能良好的NO纳米传感界面。对传感界面进行了电化学及微观形貌表征，并对所制备的NO电化学传感器的分析性能进行了综合评价。研究表明传感器具有线性范围宽、灵敏度高、响应时间短、稳定性和重现性好、特异性强等优点，可用于生物样品中NO含量的准确实时检测，具有良好的生物医学应用前景。