高 铎

(辽宁省检验检测认证中心 ， 辽宁 沈阳 110036)

大肠埃希菌和肠球菌是人和动物肠道共生菌，均为条件致病菌，可以作为社区和农场中各种细菌耐药性发生情况的指标菌[1]。藏羚羊属于脊索动物门、哺乳纲、偶蹄目、牛科、羚羊亚科、藏羚属，是我国一级保护动物[2]。由于许多野生动物是人类重要传染病的自然宿主，可能携带和传播已知或未知的病原体[3]，藏羚羊粪便标本中可能含有一定数量和种类的细菌。同时，藏羚羊在藏区内基本难以接触各类药物，其携带的细菌不易受药物影响而产生耐药。对藏羚羊粪便中大肠埃希菌和肠球菌开展耐药表型检测，可以初步了解在基本没有接触药物的情况下，藏羚羊所携带细菌的耐药情况，为研究和监测自然环境下野生动物细菌耐药发展趋势以及指导野生动物临床用药提供一定参考，在兽医领域具有重要的公共卫生学意义。相关研究表明，从藏羚羊粪便中分离获得的优势种为柠檬节杆菌、木聚糖芽孢杆菌、屎肠球菌，也可分离到粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、坚忍肠球菌等[4]，但总体文献较少，尤其少见对藏羚羊粪便中分离细菌进行耐药表型检测的相关文献。因此，本试验对从藏羚羊粪便中分离得到的大肠埃希菌和肠球菌进行了耐药表型检测。

1 材料与方法

1.1 菌种来源 大肠埃希菌质控菌株为ATCC25922，粪肠球菌质控菌株为ATCC29212，均购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司。试验分离菌株由采自4个地区的藏羚羊粪便中分离获得。

1.2 仪器 生物安全柜CLASS Ⅱ(美国NUAIRE公司)、全自动高压灭菌器(日本三洋电器集团)、恒温培养箱(德国BINDER)、VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统(BIOMERIEUX)。

1.3 培养基与材料 缓冲蛋白胨水培养基、亚硒酸盐胱氨酸培养基、胆硫乳琼脂和营养琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司；法国科马嘉沙门菌显色培养基，购自上海欣中生物工程有限公司；革兰阳性菌鉴定卡(GP鉴定卡)和革兰阴性菌鉴定卡(GN鉴定卡)，均购自BIOMERIEUX公司；肠球菌肉汤、7.5%氯化钠肉汤和营养肉汤，均购自北京陆桥技术股份有限公司；革兰阳性菌和革兰阴性菌药敏试验检测试剂盒，均购自上海复星医药(集团)股份有限公司。

1.4 方法 参照农业农村部关于印发《2019年动物源细菌耐药性监测计划》的通知[5]中《动物源细菌分离和鉴定方法》中的方法对大肠埃希菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等细菌进行分离、纯化、鉴定和体外药物敏感性测定。

1.4.1 采样采集 于4个地区采集藏羚羊粪便共计15份，0～4 ℃保存运输至实验室。

1.4.2 分离纯化 将粪便样品于9 mL 0.85%生理盐水中混匀，分别接种于营养肉汤、肠球菌肉汤、7.5%氯化钠肉汤和缓冲蛋白胨水培养基中，按规定的温度和时间进行培养。培养后分别接种于麦康凯琼脂培养基、肠球菌琼脂、亚硒酸盐胱氨酸培养基和金黄色葡萄球菌显色培养基中，按规定的温度和时间进行培养。亚硒酸盐胱氨酸培养基中培养物再接种于沙门菌显色培养基中，按规定的温度和时间进行培养。

1.4.3 生化鉴定 将上述不同培养途径获得的疑似单菌落，在营养琼脂平板上划线分离，(36±1)℃培养24 h。挑取单菌落，悬浮于3 mL 0.45%生理盐水中，制备0.5麦氏浓度的菌悬液，放入卡架中，使用GP或GN鉴定卡，按VITEK说明书操作。

1.4.4 药物敏感性试验 将无菌棉签用生理盐水润湿后，直接取过夜培养皿上数个新鲜菌落，与适量无菌生理盐水混匀。然后，用浊度计校正菌液浓度至0.5麦氏单位(1×108～2×108CFU/mL)。最后，用试剂盒中的肉汤按照使用说明书要求的倍数稀释，混匀备用。使用全自动细菌加样器，将菌液分别注入含有系列抗菌药物溶液的药敏试验检测试剂盒中，(36±1) ℃培养24 h。对革兰阴性菌进行了14种药物的药物敏感性试验；对革兰阳性菌进行了19种药物的药物敏感性试验。使用大肠埃希菌ATCC25922和粪肠球菌ATCC29212，对结果进行质控。最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)结果参照农业农村部《2019年动物源细菌耐药性监测计划》规定的抗微生物抗菌药物敏感性试验的标准进行判定。质控菌株的MIC结果均在规定范围内。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 经分离纯化和生化鉴定，从15份样品中共分离得到革兰阴性菌10株，均为大肠埃希菌；革兰阳性菌17株，其中肠球菌15株，其他2株；肠球菌中，粪肠球菌1株、屎肠球菌4株、鹑鸡肠球菌5株、海氏肠球菌2株、铅黄肠球菌2株、坚忍肠球菌1株；其他菌种中，克氏库克菌1株，婴儿链球菌1株。有3份样品同时分离出2种革兰阳性菌，有10份样品同时分离出革兰阳性菌和阴性菌，其中1份样品同时分离出2种革兰阳性菌和1种革兰阴性菌。15份样品中的14份样品分离得到肠球菌，分离率为93.3%，10份样品分离得到大肠埃希菌，分离率为66.7%。未分离到沙门菌和金黄色葡萄球菌。

2.2 药物敏感性试验 结果如表1和表2所示。分离的10株大肠埃希菌对庆大霉素、大观霉素、恩诺沙星、复方新诺明、四环素、氧氟沙星、黏菌素、美罗培南和头孢他啶敏感；对磺胺异噁唑耐药率最高，达80%，其次是氟苯尼考，耐药率为40%；1株大肠埃希菌对氨苄西林高水平耐药，1株对头孢噻呋耐药，1株对阿莫西林/克拉维酸低水平耐药；10株大肠埃希菌中，2株对2种抗菌药物呈现耐药，多重耐药菌仅1株，为3重耐药菌株。总体来看，分离的大肠埃希菌对14种抗菌药物的敏感性普遍较高，仅少数菌株表现出一定的多重耐药性。分离的15株肠球菌对阿莫西林/克拉维酸、青霉素、复方新诺明、万古霉素、四环素和多西环素敏感；对苯唑西林、头孢噻呋、头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素和磺胺异噁唑的耐药情况比较严重，耐药率均在90%以上，其中对泰妙菌素、磺胺异噁唑和头孢西丁3种药物耐药率达到了100%；其次是对替米考星和氧氟沙星耐药率较高，分别达73%和60%。肠球菌对19种抗菌药物的多重耐药现象比较严重。其中，9重耐药菌为3株，8重耐药菌为6株，7重耐药菌为4株，6重耐药菌为1株，5重耐药菌为1株。不同菌种的肠球菌表现的耐药水平和耐药率差异不显著，可能与样本量有关。

表1 大肠埃细菌的体外抗菌药物敏性试验结果Table 1 Results of in vitro antimicrobial susceptility test for Escherichia coli

表2 大肠埃细菌的体外抗菌药物敏性试验结果Table 1 Results of in vitro antimicrobial susceptility test for Escherichia

3 讨论

3.1 分离鉴定情况 对15份样品进行大肠埃希菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌的分离鉴定结果表明，肠球菌和大肠埃希菌在藏羚羊粪便中的存在比较普遍。李俊琴的研究也证实，肠球菌是藏羚羊粪便中的优势菌种[4]。蒙家嘉等[6]在藏原羚中分离得到过海氏肠球菌，本试验在藏羚羊粪便中也分离到该菌种。本试验分离的婴儿链球菌、克氏库克菌、铅黄肠球菌未见国内外相同报道，但李俊琴[4]和Bai等[7]分别从藏羚羊粪便中分离出了玫瑰考克氏菌和藏羚羊链球菌。鹑鸡肠球菌、屎肠球菌和坚忍肠球菌对人类为致病菌，但在藏羚羊体内却是正常菌群[4]，随着野生动物和人类接触的日渐增多，野生动物携带细菌传播给人类引发疾病，或人类活动影响野生动物携带细菌耐药性的情况也可能会增多，应当给予关注。本试验未见金黄色葡萄球菌和沙门菌，与国内外研究结果也较一致，说明藏羚羊并不常见金黄色葡萄球菌和沙门菌引发的疾病。

3.2 药物敏感性试验情况 本试验分离的大肠埃希菌对14种抗菌药物总体上较敏感，仅对磺胺异噁唑耐药菌株较多，对氟苯尼考中度敏感菌株较多，说明藏羚羊粪便中分离的大肠埃希菌耐药情况并不严重，可能与野生动物未受药物环境影响有关。羊云飞[8]的研究也显示，藏区牦牛源大肠埃希菌对磺胺异噁唑和氟苯尼考耐药率较高，对其他药物较敏感；分离的大肠埃希菌均对碳青霉烯类代表药美罗培南较敏感。但本试验中1株大肠埃希菌对头孢噻呋耐药值得关注，提示可能为产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)表型。本试验中分离的肠球菌对6种药物敏感，对2种药物未出现耐药，但仍然对苯唑西林、头孢噻呋、头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异噁唑、替米考星等药物呈现很高的耐药率。其中，对苯唑西林、头孢噻呋、头孢西丁、磺胺异噁唑耐药可能是由于肠球菌对头孢菌素、青霉素、磺胺类天然耐药[9]。通过与近年来对其他动物源肠球菌耐药性监测的情况进行比较[10-12]，分离的肠球菌对庆大霉素、多西环素、红霉素、利奈唑胺均呈现较低水平的耐药，甚至是未出现耐药；对氟苯尼考耐药率低于一般地区的水平，但高于藏区猪源肠球菌耐药率；对克林霉素耐药率较高，值得关注。

本试验在藏羚羊粪便中，肠球菌和大肠埃希菌有较高的分离率，而金黄色葡萄球菌和沙门菌较难分离，提示藏羚羊的健康状态较好。与国内相关研究相比，藏羚羊粪便中分离的大肠埃希菌和肠球菌耐药情况总体处于较低水平，但1株大肠埃希菌对头孢噻呋耐药，以及肠球菌对克林霉素、泰妙菌素和替米考星耐药率较高值得关注。本试验说明对藏羚羊等生活在高原无人地区较难接触药物的野生动物进行耐药性监测具有重要意义。