孙玲利，刘一思，浦发军，郝振芳，宁俊平，宋艳画

（1.河南农业职业学院，河南郑州 451450；

2.四川农业大学动物科技学院，四川雅安 625014；

3.汝州市畜牧局，河南汝州 467599）

肠道内定植着种类繁多的微生物，在宿主生理和免疫中发挥重要作用，与畜禽健康和生产性能密切相关（Wen等，2019）。随着16S rRNA测序技术的不断普及，关于家禽肠道微生物定植的研究不断取得进展。以往研究认为，禽类胚胎本身没有微生物定植（Corry等，2001）。但也有研究认为，禽类胚胎期肠道微生物的定植是由于孵化过程的存放或处理不当等原因造成的外界病原微生物的侵入（Li等，2013）。但禽类胚胎在吸收卵黄过程中是否已经有肠道微生物的定植，以及是否由外界污染造成的还需进一步研究。

在禽类孵化后期，蛋中剩余的卵黄被肠道吸收，作为胚胎后期和孵化后发育的营养来源（Ding等，2021）。因此，我们推测，在卵黄吸收的前期和后期，肠道微生物的组成和功能可能会发生变化。作为水禽，鸭具有在胚胎发育中期开始由小肠吸收卵黄的特点，且卵黄吸收与胚胎发育密切相关。但目前对鸭胚胎发育过程中肠道微生物定植的变化尚未见报道。本研究通过对卵黄吸收过程中不同时期的鸭胚胎的整个肠道进行16S rRNA测序，探究鸭胚胎肠道中是否已有微生物定植及其变化规律，旨在为鸭胚胎期的肠道微生物定植提供理论参考，同时也为禽类胚胎期的肠道微生物定植及禽类肠道微生物区系的相关研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 样品采集 将20月龄农华麻鸭的种蛋置于孵化机中孵化，在温度37.2～37.8℃，湿度55%～65%湿度的无菌房间内进行。种蛋重量平均为78.3 g，无显著性差异。在无菌条件下收集18份样品，包括孵化至第16天、22天的胚胎和出壳第一天雏鸭的整个肠道，每个阶段6个样品，用于肠道微生物的测定。将采集的样品装入EP管中-80℃保存。刚孵出的雏鸭被养在无菌室里。胚胎标本采集、微生物基因组DNA提取、PCR扩增均采用无菌操作。

1.2 DNA提取及16S rRNA测序 将16、22胚龄和出壳第一天鸭胚胎的整个肠道匀浆后，采用常用的SDS方法提取样本DNA，并采用琼脂糖凝胶电泳的方式检测DNA的纯度和浓度。同时，将提取的样本DNA使用无菌水进行稀释，将样品DNA的浓度稀释至1 ng/μL。以稀释浓度为1 ng/μL样品DNA为模板，扩增所有微生物16S rRNA序列，进行PCR扩增产物的克隆与筛选，构建16S rRNA基因文库，对16S rRNA的V3-V4高变区进行测序和数据分析。样本基因组的建库、测序工作由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 数据统计分析 利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001）对所有样品的全部待分析数据（Clean Reads）进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单位（OTUs），并基于Mothur方法和SILVA132的SSUrRNA数据库对物种进行注释分析（设定阈值为1）。肠道样品稀释曲线、肠道微生物的主成分分析（PCA）及肠道微生物的等级丰度（Rank abundance）曲线采用R软件（Version 2.15.3）进行绘制。提取KEGG数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列，并利用PAUDA和UProC两种方法注释的KEGG数据库原核生物全基因组功能信息对应到SILVA数据库中，进而实现SILVA数据库的功能注释。测序样品则以SILVA数据库序列作为参考序列聚类出OTU，进而获取肠道微生物的功能注释信息。

2 结果

2.1 微生物多样性分析及物种注释分析 首先根据测序OTUs数量绘制稀疏曲线，结果如图1 A，当测序深度＞100 reads时，曲线趋于平缓，表明测序深度合理，结果足以反映肠道菌群的物种多样性。根据丰度等级曲线分析，在物种丰度和物种均匀度方面，E22组在横轴上跨越范围较大，物种丰度最高；D1组曲线更平坦，代表物种分布更均匀，结果如图1 B所示。运用PCA比较各组微生物组成的相似性，结果如图1 C，各个阶段组间和组内都较为集中，说明各个阶段之间肠道微生物组成有一定关联。

图1 肠道微生物多样性分析

物种注释结果显示，在16、22 d的胚胎及出壳第一天雏鸭肠道微生物中共存在23个门、276个属、200个种。门水平上（图2 A），最丰富的门是变形菌门，其次是厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。属水平上（图2 B），最丰富的是假单胞菌，其次是罗姆布茨菌，还有少量拟杆菌、乳酸杆菌属、粪杆菌属等。

图2 胚胎期（E16.E22）与出壳后（D1）门、属水平上肠道菌群结构组成

2.2 微生物的功能注释分析 由图3可知，胚胎期及出壳后各阶段的肠道微生物基因富集在29个次生代谢通路上，这些信号通路大多与生长和发育有关。E16阶段肠道微生物基因主要富集在以辅酶和维生素代谢、能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等物质代谢有关的通路上。而E22阶段主要富集在遗传物质复制与修复、转运、翻译等信号通路上，和核苷酸代谢、碳水化合物代谢有关的通路上。D1阶段主要富集在信号传导、膜转运及代谢，主要是代谢和遗传信息处理。

图3 肠道微生物功能注释分析

3 讨论

早期研究认为，刚出壳的健康雏鸡消化道处于无菌状态，之后在外界开放环境的影响下逐步建立起简单的肠道微生物区系（王晶等，2020）。近年来，随着16S rRNA基因测序技术的应用，发现最初的肠道微生物定植发生在雏鸡出壳前，认为母鸡是鸡胚微生物的重要来源（Ding等，2020；Lee等，2019）。因此，本试验发现，在鸭胚胎肠道中已有微生物定植是一种正常现象。本试验进一步研究发现，胚胎期各阶段微生物的组成与出壳后第一天的微生物组成具有一定的关联性，认为母鸭微生物群是鸭胚微生物群的重要来源，并且存在从母鸭到胚、胚到雏鸭的肠道菌群传播过程。随着鸭胚胎的发育，鸭胚肠道菌群的多样性增加，出生后雏鸭体内肠道菌群的多样性呈下降趋势，肠道微生物区系由简单变为复杂，且逐渐趋于稳定。由此可见，肠道最初定植的微生物易受发育阶段的环境因素及宿主遗传的影响。

Sekelja等（2012）研究发现，在门水平上，肠道微生物菌群由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门构成，这与本研究结果一致。先前研究发现，母鸡输卵管微生物区系的核心菌属为假单胞菌、乳酸杆菌、巨单胞菌和拟杆菌，鸡胚中核心菌属为拟杆菌和粪杆菌（Lee等，2019；Gong等，2007）。而本研究表明，在鸭胚期及D1期核心菌属为假单胞菌、乳酸杆菌、粪杆菌、肠球菌和拟杆菌。由此可见，随着鸭胚胎发育，肠道中已开始有微生物定植，且各个分类层次上种类都较为丰富。进一步研究发现，随着胚胎期肠道菌群的进化，它们可能发展出更复杂的功能通路。在胚胎期，鸭肠道微生物功能主要与肠道组织结构的不断发育与功能的不断完善相适应，与胚胎期相比，D1期除了参与新陈代谢外，肠道微生物更多参与到物质转运中，提示肠道微生物功能与宿主的生长发育密切相关。

4 结论

综上所述，在鸭胚的不同发育阶段，鸭肠道中已开始有微生物定植。鸭胚的肠道微生物主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门组成，其中粪杆菌、拟杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属为核心菌属，且这些肠道微生物主要是参与营养物质代谢、遗传信息处理、信号传导、膜转运等。说明肠道微生物在鸭胚不同发育阶段均有定植，并随卵黄吸收和肠道发育发生变化，其可为鸭肠道微生物区系的进一步研究提供参考，并为禽类胚胎的相关研究提供理论依据。