李 涛，王召朋，杨明彩，李明勇，刘 曼，屈平平*

（1.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061；2.青岛康大兔业发展有限公司，山东青岛 266400）

合生素是由益生菌与益生元相互配伍而成的一种微生态制剂，可发挥1+1＞2的效果，是当前饲料生产中使用较多的一种抗生素替代品。本项目组研究发现，饲料中添加由枯草芽孢杆菌制剂、凝结芽孢杆菌制剂和低聚木糖配伍而成的合生素，可提高新西兰断奶肉兔的生产性能、免疫水平，改善肠壁形态，提高消化酶活性（李涛等，2022），具有较好的应用前景。本试验利用高通量测序技术，从基因水平分析合生素代替抗生素对新西兰断奶肉兔盲肠微生物物种丰度及多样性的影响，为合生素在肉兔生产中的推广应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 枯草芽孢杆菌制剂：活菌数为109cfu/g，由上海某公司提供；凝结芽孢杆菌制剂：活菌数为1010cfu/g，由青岛某公司提供；低聚木糖：纯度为95%，购自山东龙力生物科技有限公司。

1.2 试验设计及试验日粮 试验在山东某肉兔养殖场进行，选用300只35日龄断奶新西兰肉兔，随机分为3组，每组5个重复，每个重复20只肉兔（公、母各半）。合生素组（标记为H）饲喂添加有0.04%合生素的基础日粮；抗生素组（标记为K）饲喂添加有土霉素的基础日粮；对照组（标记为D）仅饲喂基础日粮。每天08：00和17：00投喂2次饲料，投料量以兔子充分吃饱而几乎不留料为准，预饲期3 d，正试期42 d。肉兔免疫程序及其他饲养管理按兔场常规进行。

1.3 盲肠微生物高通量测序、优势物种及组间差异性分析 在正试期第42天，每组随机选取10只试验兔进行屠宰，迅速取出盲肠内容物，放入5 mL灭菌无酶带盖离心管中，放进液氮罐中速冻20 min，然后取出放入-80℃冰箱中冷冻保存。样品委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司提取样本肠道微生物基因组DNA。根据所扩增的16S区域特点，构建小片段文库，基于Illumina Nova测序平台对该文库进行双末端测序，经过Reads拼接、过滤后得到有效数据，基于97%一致性将序列聚类成为运算分类单元（OTUs），然后对运算分类单元序列比对到Silva132数据库进行物种注释分析。为了寻找在门（Phylum）、纲（Class）、科（Family）、属（Genus）4种水平下组间的差异物种，对各组物种相对丰度做组间T-test检验，找出差异显著（P＜0.05）的物种。

表1 基础日粮配方及营养水平

1.4 数据处理 试验数据采用Excel 2010进行初步处理，利用SPSS 21.0统计软件的ANOVA程序进行方差分析，试验结果以“平均值±标准误”表示。P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果

2.1 门水平上组间差异物种 由图1可知，合生素组与抗生素组和对照组的差异物种均为脱硫杆菌门（Desulfobacterota）和放线菌门（Actinobacteriota），且合生素组脱硫杆菌门（Desulfobacterota）和放线菌门（Actinobacteriota）的相对丰度均显著高于抗生素组和对照组（P＜ 0.05）。

图1 门水平下合生素组与抗生素组、合生素组与对照组组间差异物种

2.2 纲水平上组间差异物种 由图2可知，合生素组与抗生素组和对照组的差异物种均为脱硫弧菌纲（Desulfovibrionia）、梭菌纲（Clostridia）和红蝽菌纲（Coriobacteriia），且合生素组脱硫弧菌纲（Desulfovibrionia）、梭菌纲（Clostridia）和 红 蝽菌纲（Coriobacteriia）的相对丰度均显著高于抗生素组和对照组（P＜0.05）。

图2 纲水平下合生素组与抗生素组、合生素组与对照组组间差异物种

2.3 科水平上组间差异物种 由图3可知，合生素组与抗生素组组间差异物种为脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、真杆菌科（Eubacteriaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、Atopobiaceae、伊格尔兹氏菌科（Eggerthellaceae）；合生素组与对照组组间差异物种为毛螺菌科（Lachnospiraceae）、脱 硫 弧 菌 科（Desulfovibrionaceae）、真 杆 菌 科（Eubacteriaceae）、Atopobiaceae和伊格尔兹氏菌科（Eggerthellaceae），且以上差异物种在合生素组的相对丰度最高。

图3 科水平下合生素组与抗生素组、合生素组与对照组组间差异物种

2.4 属水平上组间差异物种 由图4可知，合生素组与抗生素组组间差异物种为脱硫弧菌属（Desulfovibrio）；且合生素组与对照组组间差异物种为另支菌属（Alistipes）、毛螺菌科NK4A136组（Lachnospiraceae_NK4A136_group）和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）；且以上差异物种在合生素组的相对丰度最高。

图4 属水平下合生素组与抗生素组、合生素组与对照组组间差异物种

3 讨论

盲肠微生物群落与宿主保持着相对平衡的稳定状态，以充分发挥生物屏障作用、免疫作用、代谢作用、营养作用等，是维持动物机体健康，提高生产性能的关键。本研究发现，合生素组试验兔盲肠菌群中某些物种（如放线菌门、毛螺菌科、另支菌属、脱硫弧菌等）的相对丰度显著升高。研究表明，放线菌门（Actinobacteriota）可产生多种抗菌素，如链霉素、土霉素、四环素、庆大霉素，还能产生各种蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、维生素B12和有机酸等（陈明等，2020）。毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）包含毛螺菌属、丁酸弧菌属、罗氏菌属等细菌，该菌科具有降解毒素、抵制致病菌感染的作用，毛螺菌是典型的短链脂肪酸（SCFAs）产生菌，与粗饲料中果胶降解密切相关，能促进瘤胃微生物蛋白质合成，进而提高动物生产性能（陈丹等，2020）。另支菌属（Alistipes）属于拟杆菌门中的一种相对新的细菌属，革兰氏阴性专性厌氧，是肠道共生菌，可生产多种短链脂肪酸（丙酸和乙酸盐），具有抗炎机制，还可能对肝纤维化、癌症免疫治疗和心血管疾病等有保护作用，与链球菌存在拮抗作用（PARKER B等，2020）。脱硫弧菌（Desulfovibrio）为厌氧菌，属于耗氢微生物，也是肠道内一种重要的益生菌（李佳骏，2018）。因此，以上物种相对丰度升高，扩大了盲肠有益菌体系，使盲肠微生物菌群结构更合理化。

4 结论

本项目组配伍的合生素代替抗生素添加于兔料，未对新西兰断奶肉兔盲肠优势物种产生显著影响，且在一定程度上提高了某些有益菌的相对丰度，维持了良好的肠道微生态平衡，在兔料生产中具有一定的替抗潜力。