许晖 董江涛 王世龙 王惠 赵冬

(石河子大学医学院第一附属医院神经外科， 新疆 石河子 832008)

胶质瘤作为颅内最常见恶性肿瘤，以无限增殖和浸润著称，其中神经胶质瘤占颅内原发肿瘤的40%～50%〔1〕，威胁患者安全。微小RNA(miRNA)存在于所有细胞中，在转录后参与约1/3基因调控，从而影响癌细胞增殖、分化、凋亡等发挥作用〔2〕。miR-196b定位于同源盒(HOX)基因簇，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，从而在肿瘤的发生发展中起调控作用〔3〕。HOXA9作为HOX基因簇一员，在胶质瘤中发挥致癌作用〔4〕，且miR-196b可通过靶向调节HOXA9抑制骨髓瘤细胞的增殖和迁移，从而影响疾病〔5〕。推测miR-196b在胶质瘤中可能有类似功能。因此，本研究以神经胶质瘤U251细胞系为研究对象，过表达或干扰miR-196b后，探究其对U251细胞集落形成及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞系 人神经胶质瘤细胞U251购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.2试剂及仪器 CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天科技有限公司，货号分别为C0037、C1062L)；RNA提取试剂盒、Thermo Scientific RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技公司，货号分别为：12183018A、K1622)；一抗兔抗HOXA9、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，英国Abcam公司，货号分别为：ab191178、ab32124、ab232479、ab181602)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：D0010)；miR-196b mimic、miR-196b mimic NC、miR-196b inhibitor、miR-196b inhibitor NC、Lipofectamine 2000、HOXA9 3′UTR-WT和3′UTR-MUT均购自广州锐博生物科技有限公司；miR-196b、HOXA9、GAPDH均由上海生工生物有限公司合成。实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(美国ABI公司，型号：7500)；全自动凝胶成像分析系统(深圳市三利化学有限公司，型号：ZF-388)。

1.3细胞分组及处理 实验分为正常组、mimic对照组、miR-196b mimic组、inhibitor对照组、miR-196b inhibitor组。含10%胎牛血清DMEM培养液在37℃ 5%CO2孵箱中培养U251，至对数期时，除正常组外，其余各组参照Lipofectamine 2000说明书分别转染miR-196b mimic NC、miR-196b mimic、miR-196b inhibitor NC、miR-196b inhibitor，培养6 h后去除培养液，更换为DMEM培养液(含胎牛血清10%)培养。

1.4CCK-8检测细胞增殖情况 U251接种至96孔板中(1.0×103个/孔)，按照1.3处理各组细胞，分别在培养0、12、24、36、48 h时，按照说明书操作加入CCK-8试剂，酶标仪检测450 nm下各孔细胞光密度(OD)450，每组6个重复。

1.5qRT-PCR检测细胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平 U251接种至6孔板中，按照1.3处理各组细胞24 h，RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，Thermo Scientific RevertAid第一链cDNA合成试剂盒将其逆转录成第一链cDNA。引物序列miR-196b-正义链：5′-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-3′，反义链：5′-ACGTGCTTCTTTGTAATGACCA-3′；U6正义链：5′-ATATGGACGCTTCAATT-3′，反义链：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；HOXA9正义链：5′-GCTGAGAATGAGAGCGGG-3′，反义链5′-CAGTTCCAGGGTCTGGTGTT-3′；GAPDH正义链：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反义链5′-CCCTAGGCCCCTCCTGTTAT-3′。qRT-PCR仪对miR-196b、U6、HOXA9、GAPDH进行扩增，反应体系(20 μl)：2×SYBR qPCR Mix(10 μl)，cDNA(40 ng/μl，1 μl)，上/下游引物(10 μmol/L，0.5/0.5 μl)，ddH2O(8 μl)；反应条件：94℃、60 s；95℃、40 s，60℃、45 s，共40个循环。2-ΔΔCt法计算miR-196b、HOXA9相对表达水平。

1.6集落形成实验 U251接种至6孔板中，按照1.3处理各组细胞24 h，将各组细胞与DMEM制成细胞悬液，接种细胞至6孔板中，200个/孔，置于37℃ 5%CO2孵箱中培养10～14 d，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色5 min，清水清洗，至背景色干净后，观察细胞集落情况，计数并拍照。集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。

1.7Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况 U251接种至6孔板中，按照1.3处理各组细胞24 h，4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次，结合缓冲液用去离子水经1:9稀释后将细胞浓度调节至1×106个/ml，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl碘化丙啶染色液轻轻混匀，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.8Western印迹检测细胞中HOXA9、BCL2、BAX蛋白水平 U251接种至6孔板中，按照1.3处理各组细胞24 h，每孔加200 μl蛋白裂解液冰上裂解20 min，10 000 r/min离心20 min，上清为总蛋白。凝胶电泳分离蛋白质、聚偏氟乙烯(PVDF)转膜；5%脱脂奶粉室温封闭；对应加入一抗HOXA9、Bcl-2、Bax、GAPDH，4℃孵育过夜；加入对应二抗，室温孵育1 h；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒避光显色，全自动凝胶成像分析系统拍照和定量分析。

1.9双荧光素酶鉴定miR-196b与HOXA9的靶向关系 TargetScan查找HOXA9 mRNA的3′UTR与miR-196b结合位点。设计合成HOXA9的3′UTR-WT和3′UTR-MUT，分别与miR-196b mimic或miR-196b mimic NC共转染，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性。

1.10统计学分析 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-196b对细胞增殖的影响 5组在细胞培养0 h OD450差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组、mimic对照组相比，miR-196b mimic组细胞培养12、24、36、48 h OD450均明显升高(P<0.05)；与正常组、inhibitor对照组相比，miR-196b inhibitor组细胞培养12、24、36、48 h OD450均明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 5组细胞OD450比较

2.2miR-196b对细胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平的影响 与正常组、mimic对照组相比，miR-196b mimic组细胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平均明显升高(P<0.05)；与正常组、inhibitor对照组相比，miR-196b inhibitor组细胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

2.3miR-196b对细胞集落形成的影响 与正常组、mimic对照组相比，miR-196b mimic组细胞集落形成率均明显升高(P<0.05)；与正常组、inhibitor对照组相比，miR-196b inhibitor组细胞集落形成率均明显降低(P<0.05)。见表2、图1。

2.4miR-196b对细胞凋亡的影响 与正常组、mimic对照组相比，miR-196b mimic组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；与正常组、inhibitor对照组相比，miR-196b inhibitor组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见表2、图2。

表2 5组细胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平及细胞集落形成率、细胞凋亡率比较

图1 5组细胞集落形成

图2 5组细胞凋亡情况

2.5miR-196b对细胞中HOXA9、Bcl-2、Bax蛋白水平的影响 与正常组、mimic对照组相比，miR-196b mimic组细胞中HOXA9、Bcl-2蛋白水平明显升高，Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)；与正常组、inhibitor对照组相比，miR-196b inhibitor组细胞中HOXA9、Bcl-2蛋白水平明显降低，Bax蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图3、表3。

1～5：正常组，mimic对照组，miR-196b mimic组，inhibitor对照组，miR-196b inhibitor组。图3 5组细胞中HOXA9、Bcl-2、Bax蛋白表达

表3 5组细胞中HOXA9、Bcl-2、Bax蛋白水平比较

2.6双荧光素酶验证靶向关系 TargetScan分析发现HOXA9 mRNA的3′UTR含有miR-196b序列保守碱基。荧光素酶实验验证二者的靶向关系结果显示，与miR-196b NC+3′UTR-WT组细胞荧光素酶活性(1.01±0.14)相比，miR-196b mimic+3′UTR-WT组(0.39±0.06)明显下降(P<0.05)。见图4。

图4 TargetScan预测miR-196b与HOXA9的靶向关系

3 讨 论

神经胶质瘤发生于神经外胚层，属恶性肿瘤；发展源自细胞增殖、凋亡失衡，细胞增殖增加、凋亡降低增加胶质瘤细胞数量，局部侵袭和浸润导致疾病复发率高且预后较差〔6,7〕。因此，改变神经胶质瘤细胞的增殖、凋亡可从源头上改善疾病，实现对疾病的保护。

miRNA是一类长度9～24个核苷酸的非编码小RNA分子，可与目的基因3′UTR区域结合，影响目的基因表达，影响其mRNA或翻译水平，从而影响其功能〔8〕；而目的基因功能多样，在细胞中参与新陈代谢、氧化应激、细胞增殖、细胞周期、细胞分化和凋亡等多种过程〔9〕。其中miR-196b具有多功能性，在白血病、前列腺癌中表现出抑癌特征，在结肠癌、肺癌、胃癌、胶质瘤中表现出癌基因特征〔10〕；在胶质瘤中随着病理临床分期的严重而水平增加，转染miR-196b可促进细胞增殖〔11〕。miR-196b靶向mRNA影响细胞增殖、凋亡、侵袭等过程，从而影响疾病进程。高表达miR-196b靶向精氨酸琥珀酸合成酶1促进胃癌的侵袭和发展〔12〕；靶向叉头框P2基因在肝细胞癌中促进细胞迁移和侵袭〔13〕。在急性髓性白血病中可根据miR-196b靶向HOXA9基因调控特异基因开发出特异si-RNA用于治疗疾病〔14〕。HOXA9编码产物是一种重要的转录调节因子，与肿瘤的发生、侵袭转移等关系密切〔15〕。HOXA9在胶质瘤发生中的致癌潜能，使胶质母细胞瘤更具侵袭性，TCGA和伦勃朗的两个大数据集中证实HOXA9在胶质母细胞瘤患者中具有预后价值，其中高水平的HOXA9与较短的生存期相关〔16,17〕。本研究结果提示胶质瘤U251中升高miR-196b水平可促进HOXA9表达从而增加细胞增殖、促进癌细胞生长，减少细胞凋亡，从而加重疾病进程；降低miR-196b可通过HOXA9缓解上述过程从而缓解疾病，实现对疾病的保护。

Bcl-2是线粒体凋亡途径的重要基因，减少线粒体中Bcl-2/Rac1复合物的形成可改善神经元氧化应激损伤〔18〕。Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡基因，与Bcl-2作用相反，可与Bcl-2结合成二聚体正负调节基因〔19〕。HOXA9促进活体原位永生化星形胶质细胞的恶性转化，并导致肿瘤相关死亡，是通过上调Bcl-2实现的〔20〕。本研究结果提示过表达miR-196b可以延缓细胞凋亡；降低miR-196b水平可以降低HOXA9水平表达，下调抗凋亡基因表达，促进细胞凋亡，同时抑制癌细胞生长，实现对胶质瘤的保护。进一步研究发现，miR-196b与HOXA9存在靶位点。

综上，miR-196b在胶质瘤中低表达可促进胶质瘤细胞凋亡、抑制集落形成，从而实现对胶质瘤的保护，可能是通过降低HOXA9实现的。但miR-196b可能存在多个靶位点，也可能通过其他通路共同影响凋亡，发现新的通路并探讨其机制是本研究接下来的重点。