刘婵媛 付远兵 赵金慧 陈汉华

(武汉科技大学附属武汉市武昌医院精神心理科，湖北 武汉 430070)

认知功能障碍主要表现为记忆功能障碍，多发于老年群体〔1，2〕。由于我国人口老龄化问题日趋严重，导致近年来该认知障碍病例连年上升，引起社会的广泛关注〔3，4〕。发生老年痴呆的患者均存在认知功能障碍，有学者表示，早发现认知功能障碍，并进行积极防治，对老年痴呆预防具有重要意义〔5〕。因此本文主要研究认知功能障碍发生机制，探究新的治疗方式及针对认知功能障碍存在的治疗意义。本研究通过建立认知功能障碍大鼠模型，靶向调控miR-146a表达，观察这种方式的作用。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只SD健康雄性大鼠，由江苏科惟生物技术有限公司提供，7～10月龄，平均(8.5±1.2)个月；体重215～244 g，平均(229.5±11.6)g。在相对湿度45%～55%、温度(26.5±4.4)℃的环境中喂养大鼠，每天接受12 h太阳照射，培养1 w。本研究经医院伦理委员会批准。主要试剂：兔抗小鼠白细胞介素(IL)-1β、IL-6抗体(美国Hyclone公司)；大鼠抗小鼠S100β抗体(Gibco公司)；兔抗大鼠miR-146a抗体(美国Becton)；小鼠抗大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胞源性神经营养因子(BDNF)抗体(美国 Sigma公司)；小鼠抗兔肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(美国 Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠B细胞淋巴瘤(Bcl-2)抗体(美国 Selleck Chemicals公司)；小鼠抗兔半胱氨酸蛋白酶(caspase)3抗体(丹麦 Dako公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分组 随机从40只大鼠中抽出10只为正常组，另外30只建立认知功能障碍模型：参照刘玥欣等〔6〕研究中建模方法，对大鼠进行麻醉干预后固定，颈部去毛后对表皮进行消毒处理，纵向切开皮肤，将左侧颈总动脉、筋膜以及肌肉组织分离，对左侧颈总动脉进行结扎，局部注射青霉素预防感染，将切口缝合。将30只认知功能障碍大鼠随机分为模型组、过表达miR-146a组、沉默miR-146a组各10只，过表达miR-146a组尾部静脉注射25 mg/kg agomiR-146a，沉默miR-146a组尾部静脉注射25 mg/kg antagomiR-146a，正常组、模型组大鼠尾部静脉注射等量生理盐水。

1.2.2学习记忆能力检测 准备一个高60 cm、直径为160 cm的水池，将水池一半注入温度为21℃的水，并在水池中设置4个入水点。在水池中央设置平台，将所有大鼠从入水点放入水中，对各组由入水点游至平台的时间进行记录，若2 min还没到达平台，采用主动引到平台的方式，潜伏期计为2 min。大鼠在平台上停留一会后，再将其从其他不同入水点再次放入，进行连续测试，所有大鼠连续测试4 d，第5天撤除水池中央平台，将大鼠自入水点放入水中，记录1 min内大鼠穿越平台次数。

1.2.3标本制备 取各组大鼠尾部静脉血5 ml，3 000 r/min离心处理10 min后，使上清液分离，在-70℃环境中保存待检。麻醉处理各组，将大鼠断头处死，取其海马区脑组织，浸泡于5%甲醛中，24 h后进行石蜡包埋及连续切片处理。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色 将切片标本进行烤干、脱蜡处理。使用苏木素染色20 min后清洗3～4次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗后使用3%伊红染色，再次使用酒精对切片进行脱水、脱蜡处理，对其切片进行封片后，用显微镜观察。

1.2.5S100β、NSE、BDNF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测 酶联免疫吸附试验检测标本S100β、NSE、BDNF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。操作按试剂盒说明书进行。

1.2.6miR-146a表达检测反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-146a表达。提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录处理后获得互补DNA(cDNA)，设计引物序列，采用2-ΔΔCt方法计算miR-146a表达。

1.2.7Bcl-2、caspase3相对表达量检测 Western印迹检测Bcl-2、caspase3表达：取160℃放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，6℃苯甲基磺酰氟(PMSF)冰中孵育30 min，4℃ 2 000 r/min离心15 min，取上清。每个样品取20 g蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转入聚偏氟乙烯(PDVF)膜，7%脱脂牛奶常温下密封2 h。加入抗体过夜。取出后使用TBST液冲洗，结合第二抗体，1 h后清洗、显色，从而检测Bcl-2、caspase3相对表达量。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组脑组织病理学观察 与正常组比较，模型组、过表达miR-146a组脑组织细胞排列不规则，并且附有严重的肿胀、破裂状况；沉默miR-146a组大鼠脑组织细胞肿胀、破裂状况情况相对过表达miR-146a组较轻，且细胞排列较规则，见图1。

图1 各组脑组织病理学观察(HE染色，×400)

2.2各组学习记忆能力比较 过表达miR-146a组、模型组、沉默miR-146a组第1～4天逃避潜伏期均显著高于正常组，穿越平台次数均显著低于正常组(P<0.05)；沉默miR-146a组第1～4天逃避潜伏期均显著低于模型组、过表达miR-146a组，穿越平台次数均显著高于模型组、过表达miR-146a组(P<0.05)，见表1。

表1 各组学习记忆能力比较

2.3各组S100β、NSE、BDNF水平比较 与正常组比较，模型组、过表达miR-146a组、沉默miR-146a组大鼠S100β、NSE水平显著升高，BDNF水平显著降低(P<0.05)；与模型组、过表达miR-146a组比较，沉默miR-146a组S100β、NSE水平显著降低，BDNF水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组S100β、NSE、BDNF水平及miR-146a、Bcl-2、caspase3比较

2.4各组miR-146a、Bcl-2、caspase3表达比较 与正常组比较，模型组、过表达miR-146a组、沉默miR-146a组miR-146a、Bcl-2、caspase3表达显著升高(P<0.05)；沉默miR-146a组miR-146a、Bcl-2、caspase3水平显著低于模型组、过表达miR-146a组(P<0.05)。见表2、图2。

1～4：正常组、模型组、过表达miR-146a组、沉默miR-146a组图2 Western印迹检测Bcl-2、caspase3表达

2.5各组TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 模型组、过表达miR-146a组、沉默miR-146a组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著高于正常组(P<0.05)；与模型组、过表达miR-146a组比较，沉默miR-146a组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

3 讨 论

认知是机体脑组织接受、处理信息，并将信息转化为心理活动，进而获取所需知识、信息的过程，其中包括语言、计算、记忆、判断、执行等，认知功能障碍是指一项或多项认知功能出现损伤，进而对日常生活能力、社会功能造成影响，及时防治认知功能障碍是预防老年痴呆的关键〔7，8〕。临床常采用康复训练、药物等方式来进行恢复治疗，但其发病机制在临床医学中尚未研究透彻，临床治疗效果并不十分理想〔9，10〕。专家学者通过多种途径对认知功能障碍发病机制进行研究。其中miRNA在多种生物体中均存在，并且在自身运转过程中与炎症介质、免疫形态等相互作用〔11，12〕。研究表明，miR-146a表达变化与机体认知障碍情况具有密切联系〔13，14〕。

认知功能障碍即机体记忆功能出现障碍，并对其神经系统造成严重损伤。徐岩等〔15〕研究发现有效的干预能够发挥神经功能保护作用，改善认知功能障碍大鼠模型的学习记忆能力。本研究结果说明认知功能障碍大鼠学习记忆能力较差。本研究还发现，沉默miR-146a表达的认知功能障碍大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增加，原因可能是沉默miR-146a表达能够改善认知功能、神经功能，提升学习、记忆能力，保护机体神经系统。

S100β在机体中以细胞形态存在，位于神经系统胶质细胞中，自身表达高低与神经系统损伤程度紧密关联〔16〕。NSE作为一种酸性蛋白酶，在神经元细胞中广泛存在，作用于细胞内糖酵解〔17〕。BDNF作为神经营养因子，主要存在于机体脑组织神经系统，具有保护神经系统的作用〔18〕。本研究结果说明认知功能障碍的发生发展伴随着脑组织神经系统损伤，沉默miR-146a表达能调控S100β、NSE、BDNF水平，减轻认知功能障碍大鼠神经系统损伤严重程度。

研究发现减轻大鼠海马区炎症反应，能够减轻神经系统损伤严重程度，从而减轻大鼠认知功能障碍〔19，20〕。TNF-α、IL-1β、IL-6是临床常用的炎症因子，检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平能够对炎症反应严重程度进行评价。本研究结果说明认知功能障碍伴随着神经系统炎症反应，沉默miR-146a表达能够抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平，减轻大鼠海马区炎症反应，从而减轻大鼠认知功能障碍严重程度。

认知功能障碍、神经系统损伤与机体脑组织神经细胞凋亡之间具有极为紧密的关联性。caspase3以蛋白酶形态存在，参与机体细胞的凋亡过程。Bcl-2以蛋白形态存在于机体当中，自身具有促进细胞存活的作用，其表达变化与细胞凋亡紧密关联〔21，22〕。本研究结果原因可能是沉默miR-146a表达通过靶向调控线粒体细胞凋亡通路蛋白Bcl-2、caspase3表达，能够对海马区组织神经细胞的凋亡起到抑制作用，达到保护神经细胞的作用，减轻神经系统损伤、认知功能障碍严重程度。

综上，沉默认知功能障碍模型大鼠miR-146a表达，能够改善大鼠学习记忆能力，调控S100β、NSE、BDNF水平，靶向调控Bcl-2、caspase3表达，抑制大鼠海马组神经细胞凋亡，减轻大鼠神经损伤严重程度以及脑组织炎症反应。