梁坤 戴儒奇 黎芬 蒙锐 陈春如

(海南省人民医院 海南医学院附属海南医院核医学科，海南 海口 570311)

卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤之一，主要治疗方式为手术切除结合放化疗，但术后复发转移率高，且癌细胞对化疗药物易产生耐药性，难以治愈，严重威胁妇女健康〔1〕。随着分子生物学、遗传学及临床医学的发展，分子靶向治疗为卵巢癌治疗提供了新方向〔2〕。研究卵巢癌的发生发展机制可为分子靶向治疗提高一定基础和依据。研究发现lncRNA可参与肿瘤细胞的增殖、转移、细胞周期进程、生长和凋亡过程，在卵巢癌中也发挥重要作用〔3〕。长基因间非编码RNA(LINC00261)是一种lncRNA，LINC00261在非小细胞肺癌组织中下调，与淋巴转移、肿瘤大小、肿瘤分期及患者生存时间有关；敲低LINC00261在体外抑制了肿瘤的生长和侵袭能力〔4〕。LINC00261通过减少靶向FOXO1的miRNA抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔5〕。研究表明miRNA也参与卵巢癌的发生发展〔6〕。研究发现circRNA Cdr1as通过调节miR-1270/癌细胞侵袭抑制因子(SCAI)信号通路使卵巢癌对顺铂敏感〔7〕。骨肉瘤细胞系和原位人类肿瘤中miR-1270均异常上调表达，与骨肉瘤患者临床疗效差和总生存期短有关，下调miR-1270抑制了癌症的体外增殖和迁移及体内肿瘤发生〔8〕。hsa-miR-1270在膀胱癌患者血清中上调表达，可作为膀胱癌的新的预后生物标志物〔9〕。然而LINC00261和miR-1270对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响尚不清楚，本实验旨在研究LINC00261对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其是否通过miR-1270调控。

1 材料与方法

1.1一般资料 2010～2019年海南省人民医院海南医学院附属海南医院收治的卵巢癌术后患者52例，其中术后正常17例，术后肿瘤转移35例，年龄60～75岁。细胞与试剂：正常卵巢上皮细胞HOSE和卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780细胞购自上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自美国Progema公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、蛋白提取试剂盒、二辛可宁酸(BCA)试剂盒、RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒购自碧云天生物技术研究所；抗体购自上海斯信生物科技有限公司；细胞周期检测试剂、Transwell小室、Matrigel购于美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司。Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自美国 Bio-Rad公司。荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2正电子发射计算机断层显像/电子计算机断层(PET/CT)影像检查 Biograph TruePoint 64 PET/CT扫描仪购自德国西门子公司；静脉注射药物18F-FDG购自上海源自科业有限公司，放射化学纯度≥95%，注射剂量按患者体脂量2.96～3.70 MBq/kg注射。患者检查前禁食6 h以上，血糖在正常范围内，静脉注射18F-FDG后，患者饮水800～1 000 ml，避光条件下平卧休息60 min，进行全身PET/CT显像。扫描时患者仰卧，CT扫描条件：球管电压140 kV，电流100 mA，层厚2～5 mm，矩阵512×512；PET扫描条件：矩阵128×128，采集时间1 min/床位。利用CT扫描对PET图像进行衰减校正，采用TrueX法重建图像，获得横断面、矢状面及冠状面的PET图像、CT图像及PET/CT融合图像。由2位以上有经验的影响科医生和核医学科医生进行阅片，利用CT图像选取病灶放射性浓聚最高的层面勾画感兴趣区(ROI)，系统自动测量病灶的最大标注吸收值(SUVmax)；同时局部CT表现符合肿瘤复发或转移特征的作为判断标准。

1.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测患者血清中LINC00261和miR-1270表达 采集患者空腹静脉血，室温静置30 min，3000 r/min离心10 min，分离血清，用Bioteke法提取血清总RNA，逆转录成cDNA，LINC00261和miR-1270分别以GAPDH和U6为内参，进行PCR，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。LINC00261上游引物：5′-ACATTTGGTAGCCCGTGGAG-3′，下游：5′-TCTTCCCCGGAGAACTAGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-1270上游引物：5′-CTGGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′，下游：5′-TGCAAAGAGCCACATAGAAGAT-3′；U6上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4细胞培养 正常卵巢上皮细胞HOSE和卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5% CO2条件下培养，2 d换液一次，待细胞融合至90%左右时，进行消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.5细胞转染与分组 取对数生长期细胞ES-2，将pcDNA、pcDNA-LINC00261、si-con、si-LINC00261、anti-miR-con、anti-miR-1270转染至ES-2细胞中，分别记为pcDNA组、pcDNA-LINC00261组、si-con组、si-LINC00261组、anti-miR-con组、anti-miR-1270组；正常培养的细胞作为对照组；将pcDNA-LINC00261与miR-con、miR-1270分别共转染至ES-2细胞中，记为pcDNA-LINC00261+miR-con组、pcDNA-LINC00261+miR-1270组。

1.6RT-qPCR检测正常卵巢上皮细胞HOSE和卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780细胞中LINC00261和miR-1270的表达 提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后进行荧光定量聚合酶链式反应，具体步骤按1.3进行。

1.7Western印迹法检测细胞增殖核抗原(Ki-67)、基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白表达 各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行PAGE后转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再分别加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育90 min，TBST洗涤，用电化学发光法(ECL)发光液显影，用ChemiDoc XRS+系统成像，用Quantity One凝胶分析软件测定各组蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/β-actin条带灰度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.8MTT检测细胞活性 各组细胞培养48 h，每孔分别加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培养箱中继续孵育4 h后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次。

1.9流式细胞仪检测细胞周期 各组细胞培养48 h后收集细胞，并制备单细胞悬液，加入3 ml预冷的70%乙醇固定，用P缓冲液洗涤后加入核糖核酸酶(RNase)A于37℃水浴30 min，加入碘化丙啶(PI)，避光30 min，上机检测，重复3次。用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件检测细胞周期。

1.10Transwell检测细胞迁移和侵袭 收集各组细胞，无血清培养后，取200 μl接种于Transwell小室上层，培养24 h后，吸去培养液后用棉签轻轻擦去上层细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下拍照并计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入50 μl基质胶，凝固后接种细胞，之后同细胞迁移操作。倒置显微镜下每孔随机选取5个视野进行拍照和计数，每组重复3次。

1.11细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率 各组细胞消化后在培养皿中培养，在盘底用记号笔划线做标记，过夜细胞铺满后用枪头垂直横线划痕，用PBS冲洗划下的细胞，换液后继续培养，在培养0 h和48 h后拍照观察，用Image-Pro Plus6.0软件计算划痕面积和划痕愈合率，每组设3个重复，实验重复3次。

1.12荧光素酶报告实验检测LINC00261对miR-1270的靶向调控 Starbase数据库显示LINC00261与miR-1270存在结合位点。构建野生型和突变型基因靶点LINC00261的荧光素酶表达载体WT-LINC00261和MUT-LINC00261，用LipofectamineTM2000将WT-LINC00261和MUT-LINC00261分别与miR-con和miR-1270共转染至细胞ES-2中。按照说明书检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.13统计学分析 采用SPSS20.0软件行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LINC00261和miR-1270在术后肿瘤转移患者血清中的表达 与术后正常患者(1.25±0.47、0.93±0.36)相比，术后肿瘤转移患者血清中LINC00261表达(0.41±0.16)显著降低，miR-1270表达(3.87±1.23)显著升高(t=9.573、9.613，均P=0.000)。

2.2LINC00261和miR-1270在卵巢癌细胞中的表达 与正常卵巢上皮细胞HOSE相比，卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780中LINC00261表达水平显著降低，miR-1270表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 卵巢癌细胞和正常卵巢上皮细胞中LINC00261和miR-1270的表达

2.3过表达LINC00261抑制卵巢癌细胞存活率和引起细胞周期阻滞 与pcDNA组相比，pcDNA-LINC00261组卵巢癌细胞ES-2中LINC00261表达水平显著升高，Ki-67表达水平显著降低，细胞活性显著降低，G0/G1期和G2/M期细胞比例显著降低，S期细胞比例显著升高(P<0.05)，见图1，表2。

图1 Western印迹检测卵巢癌细胞中Ki-67蛋白表达

表2 过表达LINC00261对卵巢癌细胞存活率和周期阻滞的影响

2.4过表达LINC00261抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响 与pcDNA组相比，pcDNA-LINC00261组卵巢癌细胞ES-2中MMP-2表达水平显著降低，细胞迁移和侵袭数显著降低，细胞划痕愈合率显著降低(P<0.05)，见图2、图3、表3、图4。

图2 Transwell检测卵巢癌细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)

图3 细胞划痕实验检测卵巢癌细胞迁移(结晶紫染色，×100)

表3 过表达LINC00261对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响

图4 Western印迹检测卵巢癌细胞MMP-2蛋白表达

2.5LINC00261靶向miR-1270调控其表达 Starbase数据库预测显示LINC00261与miR-1270存在结合位点(图5)。荧光素酶报告实验显示，与miR-con组(0.96±0.13、1.25±0.12)相比，miR-1270组中转染野生型表达载体WT-LINC00261的细胞荧光素酶活性(0.45±0.07)显著降低(t=10.362,P=0.000)；而转染突变型表达载体MUT-LINC00261的细胞荧光素酶活性(1.21±0.10)无显著差异(t=0.768，P=0.454)。与si-con组(0.94±0.10)相比，si-LINC00261组miR-1270表达水平(3.65±0.59)显著升高(P<0.05)，与pcDNA组(0.91±0.09)相比，pcDNA-LINC00261组miR-1270表达水平(0.43±0.06)显著降低(P<0.05)。

2.6干扰miR-1270抑制卵巢癌细胞存活率、细胞周期和转移 与anti-miR-con组相比，anti-miR-1270组卵巢癌细胞中miR-1270、Ki-67、MMP-2表达水平显著降低，细胞迁移和侵袭数显著降低，细胞划痕愈合率显著降低，细胞活性显著降低，G0/G1期和G2/M期细胞比例显著降低，S期细胞比例显著升高(P<0.05)，见图6、表4、图7、图8。

图5 LINC00261与 miR-1270靶向结合位点

图6 Transwell检测卵巢癌细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)

表4 干扰miR-1270表达对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图7 细胞划痕实验检测卵巢癌细胞迁移(结晶紫染色，×100)

图8 Western印迹检测卵巢癌细胞Ki-67和MMP-2蛋白表达

2.7转染miR-1270部分逆转LINC00261卵巢癌细胞存活率和转移的抑制作用 与pcDNA-LINC00261+miR-con组相比，pcDNA-LINC00261+miR-1270组卵巢癌细胞中miR-1270、Ki-67、MMP-2表达水平显著升高，细胞迁移和侵袭数显著升高，细胞划痕愈合率显著升高，细胞活性显著升高，G0/G1期和G2/M期细胞比例显著升高，S期细胞比例显著降低(P<0.05)。见图9、图10、表5、图11。

图9 Transwell检测卵巢癌细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)

图10 细胞划痕实验检测卵巢癌细胞迁移(结晶紫染色，×100)

表5 转染miR-1270部分逆转LINC00261对卵巢癌细胞增殖和转移的抑制作用

图11 Western印迹检测卵巢癌细胞Ki-67和MMP-2蛋白表达

3 讨 论

卵巢癌基本治疗是在手术基础上辅以化疗，其初期缓解率较高，但仍有多数患者仍有近期或远期的复发〔10〕。肿瘤的转移和复发是影响预后的主要问题，若能及时发现、早期治疗，可以明显改善预后。PTE/CT在卵巢恶性肿瘤淋巴转移诊断中对各项指标数据有较高敏感性，能够有效预测淋巴结转移位置与情况，具有较高的临床应用价值〔11〕。本研究通过PET/CT诊断术后卵巢癌患者转移复发情况，术后部分患者卵巢正常未见肿瘤性病变的盆腔，说明没有复发；而部分患者腹膜局灶性代谢增高或盆腔内有巨大实囊性肿块，肿块实性部分代谢增高，囊性部分放射性缺损，或肝包膜下局灶性代谢增高，说明其可能发生肿瘤转移。本实验结果发现LINC00261表达水平在术后肿瘤转移患者中显著降低。研究报道LINC00261在胃癌组织中低表达，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及5年存活率显著相关〔12〕。LINC00261过表达可抑制肝细胞癌细胞增殖、侵袭〔13〕。过表达LINC00261抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，抑制癌细胞集落形成并增强细胞凋亡〔14〕。LINC00261在子宫内膜异位症组织中显著下调，过表达LINC00261通过直接结合miR-132-3p来调节BCL2样蛋白(BCL2L)11表达可抑制子宫内膜异位症细胞的增殖和侵袭〔15〕。本实验结果说明过表达LINC00261可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，并将细胞阻滞于S期。

研究表明部分miRNA在卵巢癌中异常表达，可能参与卵巢癌的发生发展过程，在卵巢癌的诊断及治疗中也起重要作用〔16〕。研究报道circRNA Cdr1as通过miR-1270抑制上调凋亡蛋白酶激活因子(APAF)1表达，增强了膀胱癌细胞的顺铂化学敏感性〔17〕。circRNA Cdr1as过表达通过使miR-1270海绵化促进了肝癌细胞的增殖和迁移〔18〕。miR-1270下调通过调节SCAI抑制了甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移和体内移植〔19〕。本实验结果还说明抑制miR-1270表达可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，并将细胞阻滞于S期。且本实验还提示，LINC00261可能通过调控miR-1270影响卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上，过表达LINC00261可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，并阻滞细胞于S期，其机制可能与miR-1270有关。