王文逸，史振国，冯俊成，毛旭华

(1.苏州大学附属独墅湖医院肿瘤内科，江苏 苏州 215000；2.江苏大学附属宜兴医院心胸外科，江苏 无锡 214200；3.江苏大学附属宜兴医院检验科，江苏 无锡 214200)

食管癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一[1]，我国是食管癌高发地区，其发病率位居恶性肿瘤的第三位，死亡率位居第四位[2]，虽然近年来食管癌治疗取得了很大进展，但由于大多数食管癌患者确诊时已进展至晚期，故其5年生存率，仅有 19%[3-5]。因此，进一步研究食管癌的发病机制并寻找相关标志物显得尤为重要。CST1基因定位于20p11.21染色体，其编码一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin SN，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的2型亚家族[6]。近年来，国内外有大量研究显示CST1基因与肿瘤发生和发展密切相关[6-8]。但是鲜见CST1基因在食管癌中的研究报道。本研究利用肿瘤基因组图谱(TCGA)等数据库，采用生物信息学技术对食管癌组织中CST1基因进行大数据分析，以期为食管癌的发病机制和早期诊断提供进一步的科学依据。

1 资料与方法

1.1资料来源与数据处理:基因分析中常用的数据库：TCGA(网址：https：//portal.gdc.cancer.gov/)，癌症数据在线分析和挖掘数据库(UALCAN，网址http：//ualcan.path.uab.edu)。正常人基因型-组织表达数据库(Genotype-Tissue Expression，GTEx，网址：https：//commonfund.nih.gov/GTex)，基因表达谱数据动态分析数据库(GEPIA，网址：http：//gepia.cancer-pku.cn/)，人类蛋白质图谱图像分类数据库(HPA，网址：https：//www.proteinatlas.org)。

利用GEPIA和 UALCAN数据库比较不同肿瘤类型TCGA数据库和GTEx数据库中肿瘤组织和正常组织数据。采用方差分析，选择log2(TPM+1)参数对基因表达数据进行转换。利用HPA数据库分析CST1蛋白在正常食管鳞状上皮细胞中的表达。利用UALCAN数据库对CST1在食管癌不同人种中及在食管癌患者不同临床病理特征下的表达数据进行分析。利用UALCAN数据库分析CST1表达对食管癌患者生存期的影响。

1.2细胞系、试剂及仪器:TE-1和 KYSE520人食管癌细胞系购自美国菌种保藏中心(ATCC)。CST1 siRNA两条序列(按照参考文献合成[8])及其阴性对照(NC)由广州锐博公司合成和提供。RPMI-1640、Opti-MEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco公司)。CCK-8(日本同仁化学研究所)。Lipofectamine3000 转染试剂、Trizol试剂和10%Bis-Tris预制胶套装(美国Invitrogen 公司)。Primescript逆转录试剂盒(大连宝生物公司)。SYBR®Select Master Mix试剂盒(美国 ABI 公司)。兔抗人CST1多克隆抗体(批号：16025-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司)、兔抗人Cyclin D1多克隆抗体(批号：2978)以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(批号：7074，美国Cell Signaling公司)，兔抗人β-actin多克隆抗体(批号：AP0060，美国Bioword公司)。细胞周期和凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒和ECL发光试剂盒(上海碧云天公司)。酶联仪(美国Biotek 公司)，BD FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD公司)，NanoDrop 2000 超微量分光光度计(美国Thermo Scientific 公司)，ABI 7300 荧光定量PCR仪(美国ABI 公司)，Western印迹电泳设备及化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3细胞培养：TE-1和 KYSE520细胞系分别给予含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的CO2培养箱中常规培养，每3～4天传代1次，后续实验取对数生长期细胞。

1.4siRNA细胞转染：取对数生长期的TE-1和 KYSE520细胞，6孔细胞培养板中每孔接种约2×105个细胞，常规培养24 h后按照Lipofectamine3000说明书进行转染，实验分为siNC组(NC siRNA转染组)、siCST1-1组(CST1 siRNA序列1转染组) 和siCST1-2组(CST1 siRNA序列2转染组)，每组设4个复孔，其中1复孔转染24 h 后用于CCK-8检测；1复孔转染48 h验证mRNA 表达；其余复孔转染72 h分别用于检测蛋白表达和细胞周期分析。实验均重复3次。

1.5CCK-8法检测细胞的增殖活力：取上述1.4中转染24 h细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔接种2 000个细胞，每组设6个复孔，同时设立空白调零组(仅加培养液)。常规培养0 d、1 d、2 d、3 d、4 d后，按照 CCK-8 试剂盒说明书加入CCK-8，继续培养1 h后在酶联仪上测450 nm波长处的吸光度值(A值)，OD值=A(细胞组)-A(空白组)。

1.6实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达：根据 Trizol 试剂说明书提取上述1.4中转染48 h 细胞(约106个)总RNA，NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定总RNA浓度和比值(A260/A280均在1.8～2.0之间)，取1 μg RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。按照参考文献，采用实时荧光定量 PCR 检测CST1 mRNA表达水平，结果以2-ΔΔCt法计算，公式：ΔΔCt = [(实验组Ct目的基因/实验组Ct内参基因) -(对照组Ct目的基因- 对照组Ct内参基因)]。实验均重复3次。

1.7流式细胞术检测细胞周期：取1.4中转染72 h后细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集所有细胞，1 000 r/min，5 min；冰浴预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗1遍后加入1 ml冰浴预冷70%乙醇，轻轻吹打混匀，-20℃固定。固定24 h后按照细胞周期和凋亡试剂盒说明书进行操作上机收集荧光信号并分析。实验均重复3次。

1.8Western印迹检测蛋白表达：取上述1.4中转染72 h细胞(约2×106个)，预冷PBS洗2遍加入预冷的RIPA蛋白裂解液冰浴裂解抽提蛋白，4℃，12 000 r/min，15 min；取上清按试剂盒说明书BCA 法测定蛋白浓度，按照预制胶套装说明书蛋白变性后取15 μl(30 μg)加入10%Bis-Tris预制胶中，200 V电泳40 min，电泳结束后在400 V 恒压条件下2 h将蛋白质转至PVDF膜上，5%BSA封闭1 h。分别加入兔抗人CST1抗体(1∶1 000稀释)、兔抗人Cyclin D1抗体(1∶1 000稀释)以及兔抗人β-actin 抗体(1∶5 000稀释)，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)后室温下孵育1 h，TBST洗膜5次后ECL化学发光法显影后经化学发光成像系统曝光检测目的条带。实验均重复3次。

1.9统计学分析：采用GraphPad Prism5.01统计学软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结果

2.1CST1在不同肿瘤中的表达：GEPIA数据库分析结果表明，在33种不同肿瘤类型中，CST1 mRNA在食管癌，膀胱尿路上皮癌，乳腺浸润癌，结肠腺癌，头颈部鳞状细胞癌，肺腺癌，肺鳞癌，卵巢浆液性囊腺癌，胰腺癌，直肠腺癌，胃癌，睾丸癌，子宫内膜癌等13种肿瘤中表达上调。见图1。GEPIA数据库和TCGA数据库分析结果表明CST1在食管癌中显著高表达(P<0.05)。见图2。

ACC：肾上腺皮质癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸润癌；CESC：宫颈鳞癌和腺癌；CHOL：胆管癌；COAD：结肠腺癌；DLBC：弥漫性大B细胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：多形性胶质母细胞瘤；HNSC：头颈部鳞状细胞癌；KICH：肾嫌色细胞癌；KIRC：肾透明细胞癌；KIRP：肾乳头状细胞癌；LAML：急性髓细胞样白血病；LGG：脑低级别胶质瘤；LIHC：肝细胞肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鳞癌；MESO：间皮瘤；OV：卵巢浆液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；PRAD：前列腺癌；READ：直肠腺癌；SARC：肉瘤；SKCM：皮肤黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睾丸癌；THCA：甲状腺癌；THYM：胸腺癌；UCEC：子宫内膜癌；UCS：子宫肉瘤；UVM：葡萄膜黑色素瘤。图中红色代表肿瘤组织，绿色代表正常组织对照。T：肿瘤组织，N：正常组织，n：数量。X轴：肿瘤组织和正常组织数量，Y轴：每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本log2(TPM+1)图1 GEPIA数据库中CST1在不同肿瘤中的表达

A：GEPIA数据库中CST1在食管癌中的表达，B：TCGA数据库中CST1在食管癌中的表达;图中红色代表肿瘤组织，黑色代表正常组织对照。X轴：肿瘤组织和正常对照组织数量，Y轴：A图每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本log2(TPM+1)；B图每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本,①P<0.05图2 CST1 mRNA在食管癌中的表达

2.2CST1蛋白在正常食管鳞状上皮细胞中的表达:HPA数据库中三种不同抗体(三家不同公司生产的CST1抗体)免疫组化分析结果均显示，CST1蛋白在正常食管鳞状上皮细胞中不表达。见图3。

图3 三家不同公司生产CST1抗体检测CST1蛋白在正常食管鳞状上皮细胞中的阴性表达

2.3CST1在不同人种食管癌患者中的表达:UALCAN数据库分析表明，东亚人群中CST1在食管癌患者肿瘤组织中显著高表达(P<10-7)。见图4。

X轴：Normal(正常对照)，Caucasian(高加索人)，African-American(非洲裔美国人)，Asian(亚洲人)；Y轴：TPM(每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本)图4 CST1在不同人种食管癌患者中的表达

2.4CST1表达与食管癌患者临床病理特征的关系:UALCAN数据库分析表明，CST1在食管肿瘤鳞状细胞癌和腺癌组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图5A。食管癌肿瘤分期Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期肿瘤组织中CST1与正常组织相比高表达(P<0.05)。见图5B。肿瘤分级Ⅰ级、Ⅱ级肿瘤组织中CST1与正常组织相比高表达(P<0.05)。见图5C。淋巴结转移状态N1，N2和N3肿瘤组织中CST1与正常组织相比高表达(P<0.05)。见图5D。

图5 CST1表达与食管癌患者临床病理特征的关系

2.5CST1表达对食管癌预后的影响:UALCAN数据库分析结果表明，CST1高表达的食管癌患者生存期与CST1中低表达的食管癌患者相比，差异无统计学意义(P=0.95)。见图6A。CST1表达结合肿瘤分级表明，生存期差异有统计学意义(P=0.034)。见图6B。

A：CST1表达对食管癌患者生存的影响；B：CST1表达结合肿瘤分级对食管癌患者生存的影响图6 CST1表达对食管癌预后的影响

2.6siRNA敲低CST1后对食管癌细胞株细胞增殖能力的影响：两条CST1 siRNA转染TE-1和 KYSE520细胞后，实时定量PCR检测结果表明，与siNC组相比siCST1组CST1的表达水平均显著下调。见图7A；CCK-8结果显示在两株细胞中siCST1-1和siCST1-2组细胞在培养2 d后OD值均低于siNC组，差异均有统计学意义(P<0.01)，敲低CST1抑制了细胞的增殖能力。见图7B，图7C。

A：实时定量PCR检测结果；B,C：CCK-8试验检测细胞增殖能力；与siNC组相比，①P<0.01图7 siRNA敲低CST1后对TE-1和 KYSE520细胞增殖能力的影响

2.7siRNA敲低CST1后对食管癌细胞株细胞周期的影响：两条CST1 siRNA转染TE-1和 KYSE520细胞后，细胞周期检测结果表明，与siNC组相比，siCST1-1和siCST1-2组G1期细胞增加，而G2和S期细胞减少。见图8A、图8B；Western印迹结果表明，两株细胞中siCST1-1和siCST1-2组CST1和cyclin D1蛋白表达水平均显著低于siNC组。见图8C。以上结果表明siRNA敲低CST1后细胞周期阻滞。

A、B：流式细胞术检测siRNA转染后对细胞周期的影响；C：Western印迹检测CST1、Cyclin D1蛋白结果图8 siRNA敲低CST1后对TE-1和 KYSE520细胞周期的影响

3 讨论

近年来，随着生物信息学的发展，生物医学已进入大数据时代。基于数据的获取积累、汇聚共享及挖掘利用的大数据分析技术在生物医学的基础研究和临床诊治中发挥了重大作用。研究者们可以通过TCGA数据库等平台高效处理和分析海量基因测序数据，从中获取高质量的个性化肿瘤基因信息，并测试他们的研究假设[9]。

恶性肿瘤的发生和发展与基因突变、基因异常表达有着密切的关系。研究显示CST1表达与肿瘤发生和发展以及侵袭转移密切相关[10]。冯莉等研究[7]指出，CST1在结直肠癌中高表达，且高表达患者生存期缩短，过表达CST1能够促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。Dai等学者的研究[8]表明，CST1在膀胱癌中高表达，且CST1表达上调的患者复发率高。Choi等学者指出，胃癌中CST1基因高表达，RNA干扰其表达后可降低细胞增殖[11-12]。Dai等学者的研究[8]表明，CST1在乳腺癌组织中高表达，且与乳腺癌患者生存期负相关，CST1过表达可促进乳腺癌细胞的增殖，克隆形成，迁移及侵袭能力。而Chen等学者在食管癌中的研究[13]却得出不同的结论，CST1在食管癌组织中低表达，而在正常组织中高表达，CST1表达与食管癌患者生存期呈正相关。

本研究从生物信息学角度，利用TCGA等数据库分析表明CST1在结直肠癌，膀胱癌，胃癌，乳腺癌等肿瘤组织中高表达，这一结果与前述学者的研究一致。但数据库分析表明CST1在食管癌组织中高表达，东亚人群中CST1在食管癌患者肿瘤组织中显著高表达。且HPA数据库中免疫组化分析结果显示，CST1在正常食管鳞状上皮细胞中不表达。这些结果均与Chen等学者CST1在食管癌组织中低表达的研究[13]结果相悖，推测可能是样本选择偏倚的原因，具体原因需进一步研究。本研究进一步通过细胞生物学实验证实，敲低CST1抑制了细胞的增殖能力且细胞周期阻滞。

Choi等的研究[11]首次将CST1表达情况与患者pTNM分期结合分析，结果表明胃癌患者的pTNM分期越晚，肿瘤组织内CST1表达越高。同时 CST1 的表达与淋巴结转移相关。本研究生物信息学分析结果也得到相似结果，同时食管癌患者CST1表达结合肿瘤分级分析，生存期差异有统计学意义。

CST1表达与肿瘤发生和发展以及侵袭转移之间的机制目前尚不明确。Kim等学者的研究[14]认为CST1可与Cathepsin B竞争性结合CST3，该竞争性结合作用可以抵消CST3对组织蛋白酶的抑制活性，使细胞中组织蛋白酶活性恢复，进而促进肿瘤的发展。而徐湖波等学者的研究[12]认为抑制CST1表达可降低p-STAT3，PCNA，MMP-2和MMP-9的表达，提示CST1基因对结直肠癌细胞生长的影响与下调STAT3信号通路有关。本研究尚未对其机制开展进一步研究。

综上所述，本研究通过生物信息学技术，对TCGA等数据库中食管癌患者CST1基因进行分析，表明CST1在食管癌患者中高表达。其表达与临床病理特征及生存期相关。同时从细胞生物学的角度验证了敲低CST1抑制了细胞的增殖能力且细胞周期阻滞。CST1表达与食管癌发生和发展以及侵袭转移之间的机制值得进一步的研究。CST1基因可能是食管癌治疗和预后的潜在靶标。