李永乐,杨 恒,汪 渊,郝志强,王敬珅,钱 彪

(1.石河子大学，新疆 石河子 832000；2.东营市人民医院，山东 东营 257000；3.聊城市第二人民医院，山东 聊城 252000；4.赣南医学院第一附属医院泌尿外科，江西 赣州 341000)

肾结石作为泌尿系统的常见病与多发病，严重影响人们的工作及生活，有流行病学研究显示，泌尿系结石的患病率及发病率逐年递增[1]，其中原因包括医疗诊治技术的提高和人民生活水平及生活方式的改变，而且，晶体的聚集及生长诱导肾损伤病理形成和晶体物质对肾小管上皮细胞的刺激有直接的关联，在有些晶体物质的刺激下，肾小管细胞对其做出氧化应激及炎性反应，更容易加速肾结石的形成与发展。近几年发展过程中，很多研究表明肾结石患者发生代谢性疾病的可能性相应增加，即部分代谢性疾病的发生和结石有直接的关联。机体的微炎性反应状态、氧化应激激活的发生也会对肾结石的发生产生影响，肾脏疾病的发病率上升。肾小管上皮细胞在晶体物质的刺激作用下，会分泌一些物质，其中最主要的物质就是骨桥蛋白(OPN)。

相关研究发现，OPN是结石基质蛋白的主要成分，是一种存在于人体钙化肾结石中的糖蛋白，OPN作为草酸钙结石中含量最为丰富的蛋白之一，与肾结石的聚集形成有一定的相关性[2]。OPH可进一步诱导炎性细胞如单核-巨噬细胞迁移到病变部位，从而加重结晶部位的炎性反应，引起恶性循环。通过研究已知结晶的形成是一种生物矿化的过程，骨OPH参与这一过程并发挥重要作用。

OPN是草酸钙结石基质的重要成分[3]，可能通过促进晶体黏附及介导氧化应激、细胞凋亡促进结石的形成[4]。对OPN与肾结石形成机制的研究，有助于为肾结石寻找新的预防及治疗靶点，李征等研究[5]表明，血清OPN水平及尿液渗透压升高可导致儿童肾结石的发生。OPN作为肾结石中的一种重要基质蛋白，其通过细胞内信号转导途径，促进草酸钙晶体黏附于肾小管上皮[6]，且OPN的强阴离子活性，使其能容易与尿液中的Ca2+结合，成为草酸钙晶体聚集的促进剂，导致钙盐沉积，诱发肾结石的形成[7]。

Igor Tamm和Frank Horsfall首先从正常人尿液中分离纯化出一种能抑制病毒诱导血凝的黏液糖蛋白并命名为Tamm-Horsfall蛋白(THP)[8]，THP又称为尿调节蛋白，是肾脏髓袢升支粗段和远侧曲管所合成并分泌的一种蛋白，经后续研究发现，这种蛋白不仅对T细胞增殖和单核细胞毒性具有体外免疫抑制的作用[8]，人们还推测出THP的其他生理作用，主要有参与介导盐和水潴留、从而预防高血压、预防肾结石形成、预防尿路感染以及可能在肾脏损伤中的作用。它自身的物理结构决定它在酸性介质中常以凝胶的形式存在，即尿液中透明管型的主要组成成分。

THP在尿中的排泄量较少，且受多种疾病的影响，如泌尿系梗阻、肾小管间质性肾炎、肾移植排斥反应等有着重要关系，当尿液及血清中检测到高浓度的THP及抗THP抗体时常见于泌尿系梗阻及肾移植排斥反应[9]。THP可与中性粒细胞膜表面的整合素结合，导致肾小管间质细胞中炎性细胞聚集，这些炎性细胞产生的炎性反应因子和蛋白酶，可引起细胞组织损伤和细胞的吞噬作用[10-11]。当肾小管管腔内压力增高或肾小管上皮细胞损伤时，分泌的THP经过破损的肾小管漏入肾小管管腔内，导致管腔内THP大量堆积，形成THP 管型，是造成肾功能衰竭的因素之一。酸性尿液、钙离子、造影剂等都会造成THP的聚集[12]。上述研究表明 THP与肾小管损伤、炎性反应和钙盐晶体形成有着密切的联系。也有体外试验表明，高渗状态、酸性条件(H+)和THP本身浓度的增加会促进THP的聚集，从而引起凝胶的形成，继而就会形成透明的管型甚至肾结石。因此，THP不仅能促进草酸钙晶体形成，且在某些病理条件下参与了尿石症的发病机制[13]。

国内外均有研究表明，THP在代谢性疾病合并肾结石疾病中，有重要参考价值与意义。隋艳斐等研究[14]发现：糖尿病肾病中，可以将THP、α1-MG、β2-MG作为患者肾脏早期受损的重要指标。而在原发性高血压合并肾结石的形成过程中，也有相关研究表明：THP为膀胱黏膜层中含量最多的且具有保护功能的尿糖蛋白，但是THP也是肾小管铸型的主要成分，THP聚集已被认为是引起肾小管梗阻的急性肾功能衰竭发病机制的因素。本研究试图通过纳米细菌建立肾结石模型，动态观察纳米细菌肾结石的形成过程中OPN、THP的表达及与肾结石的相关性研究。

1 材料与方法

1.1材料：新疆医科大学实验动物中心SPF级Wistar雄性大鼠[合格证号：SCXK(新)2013-0001]，常规饲养6周后，筛选出90只体重约为(200±20) g的大鼠，基本饲料(石河子大学实验动物中心)，10%中性福尔马林(石河子大学医学院病理科赠)，四环素(四川科伦药业)，TG(Biofroxx)，电转液、PBS(国药化学试剂公司)，蛋白marker(10～250 kD)(海利克思)，PVDF膜(0.45 μm)、ECL底物液(美国罗氏公司)，兔多抗GAPDH(37 kD)、羊多抗OPN(25 kD)、兔多抗THP(121 kD)、HRP标记羊抗兔二抗、HRP标记兔抗羊二抗(Cell Signaling Technology)。

1.2方法：参考本课题组之前用纳米细菌建立肾结石模型的方法建立模型后随机分组：纳米细菌组(NB组)：Wistar大鼠尾静脉注射纳米细菌悬液1.2 ml+2 ml生理盐水灌胃；抗纳米细菌组(NBT组)：Wistar大鼠尾静脉注射纳米细菌悬液1.2 ml+2 ml四环素溶液灌胃；对照组(NC组)：Wistar大鼠尾静脉注射生理盐水1.2 ml+2 ml生理盐水灌胃，基本饲料标准化饲养1周后，每周每组随机抽取3只大鼠，无菌采集肾脏标本后处死，共计10周。运用Western印迹检测大鼠肾脏组织中OPN、THP的表达量并分析结果。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.3统计学方法：采用SPSS23.0统计学软件进行数据分析，用ImageJ测量目的条带灰度值，相同时间段的组间比较用One-way ANOVA-LSD方差分析，相关分析采用Pearson相关系数表示。

2 结果

2.1各组大鼠肾脏组织中OPN表达量结果：试验结果取各组大鼠肾脏，采用Western印迹检测其OPN蛋白表达含量。以第8周为例，试验结果较好，可见条带清晰，内参稳定，X线片上，NB组、NBT组、NC组均可见清晰地黑色条带，表明三组大鼠中均有OPN蛋白表达，但其表达量有所差别，NBT组OPN蛋白含量最高，NC组次之，NB组大鼠肾脏组织中OPN蛋白表达最低，对其进行统计学处理，结果显示NB组、NBT组和NC组三组之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与NC组比较，①P<0.05;与NBT组比较，②P<0.05图1 三组大鼠肾脏组织中OPN蛋白表达对比

2.2各组大鼠肾脏组织中THP表达量结果:以第8周为例检测三组大鼠肾脏THP蛋白的表达含量，X线片上，NB组条带颜色较浅，NBT组、NC组均可见清晰地黑色条带，由此可见三组大鼠中TH蛋白表达量有所不同，NB组大鼠肾脏组织中THP含量最低，NC组THP表达居中，NBT组大鼠肾小管上皮细胞THP分泌最多，统计学检验结果，NB组、NBT组和NC组三组之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与NC组比较，①P<0.05;与NBT组比较，②P<0.05图2 三组大鼠肾脏组织中THP蛋白表达对比

2.3OPN、THP相关性分析结果:对两种蛋白利用Pearson相关性分析，结果显示，所研究的两种蛋白OPN与THP联系紧密，增长趋势具有一致性，二者极强相关(r=0.951，P<0.01)。见图3。

图3 OPN与THP的相关性分析

3 讨论

肾结石是泌尿系统结石的主要组成部分之一，由于结石易复发、病情反复且并发症多，已成为很多患者严重的负担。目前肾结石的形成机制仍不清楚，既往观点认为肾结石的形成过程包括尿液过饱和、晶体核心形成、晶体成长及聚集，然而目前越来越多的研究者强调肾小管上皮细胞与结石晶体间的相互影响[15]。有研究表明，联合分析尿液中OPN与THP的含量，可作为肾结石早期诊断的标志物[16]，研究显示，体外钙刺激大鼠肾脏上皮细胞可诱导细胞OPN基因表达上调，OPN分泌增加[17]。而OPN的过度表达，能刺激机体分泌前列腺素，单核细胞趋化蛋白-1等一系列多种炎性因子，在局部产生氧化应激反应，从而诱发炎性反应，造成晶体的沉积与钙化[18]。张杰[19]通过体外构建人肾小管上皮细胞结晶肾损伤模型证实LncRNA MALATI通过吸附miR-127-Sp调控OPN并影响细胞增殖及黏附活性进而参与草酸钠结晶肾损伤的发生过程，能为晶体刺激肾脏细胞导致肾脏损伤提供有力证据，另一方面Yamate等[20]也证实在肾结石形成的早期阶段，OPN具有促进草酸钙结晶在细胞上沉积和黏附的作用，通过减低OPN表达可抑制草酸钙晶体的沉积。因此，结石形成早期阶段，OPN可能促进了NRK与草酸钙结晶体的结合过程。

OPN作为肾结石的主要基质蛋白，一方面可促进晶体聚集、黏附、沉积，从而加速结石的形成，另一方面它的过度表达可诱发集体产生众多炎性反应因子，引起肾脏慢性炎性反应，进一步造成晶体的沉积。肾脏慢性炎性反应的诱发，可引起肾脏功能的损伤，从而导致电解质代谢紊乱，进而诱发晶体的过饱和、沉积；大量晶体聚集和黏附，长期导致结石的形成，结石形成又会引起肾脏慢性炎性反应，如此循环，加快结石的形成和肾脏的损伤。

THP是人体尿液中的一种特异性阴离子蛋白，主要由肾小管上皮细胞分泌，混合于尿液中作为代谢废物经尿道排出体外[21]。有报道称，THP蛋白是草酸钙晶体形成的抑制剂，是预防肾结石和肾集合系统感染的首道防线[22]。尿液THP、NGAL、血清Cys C与β2-MG可作为CKD患者早期评价GFR的敏感指标，联合NGAL、THP作联合预测因子可提高早期诊断肾损害的灵敏度及特异性，对于早期发现CKD患者肾小管损伤并评估其损害程度有重要的临床意义[23]。所以THP可以在肾脏早期损伤中作为重要观察指标，正常生理情况下，THP蛋白可对肾小管上皮细胞起到保护作用，其强烈的抗氧化作用，可有效减少氧自由基和过氧化物的产生，削弱肾脏组织局部氧化应激反应，减轻肾小管上皮细胞的损伤，降低结石的形成，而在肾结石患者尿液中，这种抑制作用却很弱，难以起到防治肾结石形成的作用[24]。

OPN与THP两种蛋白均与肾结石的发生发展有密切关系，研究表明，通过结合分析尿液中OPN与THP的含量，可作为肾结石早期诊断的标志物，且特异性高、敏感度好[16]。

综上所述，OPN与THP均参与肾结石的形成与发展，且在肾结石患者中都有较高表达，OPN通过加速晶体黏附及聚集并参与体内氧化应激、诱发慢性炎性反应，从而引起肾结石的形成与发展；THP作为肾脏分泌的糖蛋白，生理条件下可参与体内水盐，预防高血压、肾结石的形成等，但在某些病理条件下大量THP产生、潴留可引起肾脏管型析出，进而引起肾结石的形成。本研究结果显示OPN、THP蛋白在三组大鼠中均有表达，因为OPN、THP蛋白作为尿液中正常的成分而存在，因此即使对照组无诱石因素的存在，依然可以检测到一定表达，但是三组表达量却差异明显，其中NBT组大鼠肾脏组织中表达最高，NB组含量最低，可能是因为四环素的抗菌作用，大鼠机体自身反馈调节，抑石物质表达增加，而NB组由于纳米细菌对大鼠肾脏组织的损害，使OPN、THP表达减少，肾脏组织局部炎性反应明显。

根据Pearson系数等级划分，相关系数在0.8～1.0之间为极强相关，在0.6～0.8之间为强相关，代表肾脏局部炎性反应程度的两种蛋白OPN与THP联系紧密，增长趋势具有一致性，二者极强相关(r=0.951，P<0.01)。

综上所述，OPN、THP两种大分子蛋白属于尿液中的正常成分，二者作为抑石物质而发挥其功能。尿液中OPN的作用是通过抑制草酸钙结晶的聚集、减小结晶体积、降低晶体黏附性等方面，从而有效抑制结石的形成。THP则通过抑制钙盐成核生长、竞争性与钙离子结合等方式抑制结石形成。纳米细菌对大鼠肾脏的影响可能是：使肾脏抑石成分分泌不足，达不到抑制结石形成的有效浓度，因此NB组大鼠肾脏组织中OPN、THP含量较低，由此可见体内抑石物质的缺乏是肾结石的主要形成原因之一。

OPN和THP在尿液中的早期可检测性可以在早期肾结石患者的形成所致肾损伤提供参考依据，OPN和THP的实时检测可为人们在预防肾结石的形成与发展中起到重要作用，这也将为如何利用OPN和THP防治肾结石及肾脏慢性损伤提供新的思路。