郭春辉，梁科峰，张小伟

皮肤黑色素瘤在皮肤恶性肿瘤中排行第三，大约占皮肤癌的10%，具有高侵袭、恶化程度高、预后差等特点［1-2］。据报道，在亚洲国家黑色素瘤的发病率远低于欧非国家，而现在中国黑色素瘤新发现的病例以每年约2万例的趋势上升［3-5］。目前关于黑色素瘤的治疗首选还是以临床外科治疗为主，以延长病人的生存时间［6］。虽然黑色素瘤在治疗方面取得了较大的进展，但是其发病率和死亡率依然居高不下［7］。因此，需要寻找与皮肤黑色素治疗相关的新靶标以及分子机制。

大多数研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）和miRNA（MicroRNAs）在人类疾病的发生和发展中发挥着重要作用［8-9］，且长链非编码RNA可以通过调控miRNA的表达参与癌症细胞的增殖、凋亡、周期和转移等。研究表明，LINC00662在结肠癌［9］、宫颈癌［11］、肺癌［12］、胃癌［13］等肿瘤中有相关的报道，而在皮肤黑色素瘤中的表达和作用机制研究未见报道。本研究通过生物信息学网站预测了LINC00662的3’UTR存在miR-103a-3p连续的结合位点。有研究表明，miR-103a-3p在肺癌中表达下调，过表达miR-103a-3p能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移等［14］。杨雨澎等［15］研究表明，过表达miR-103a-3p抑制肝癌细胞的增殖、阻止细胞周期阻滞。关于LINC00662和miR-103a-3p在皮肤黑色素瘤中功能尚不清楚。因此，本研究于2018年10月至2020年2月，以黑色素瘤为研究对象，观察沉默LINC00662、抑制miR-103-a-3p对黑色素瘤细胞增殖、周期的影响，为黑色素瘤的治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料皮肤黑色素瘤组织及正常组织的样本均从平煤神马医疗集团总医院于2018年10月至2020年2月确诊的26例皮肤黑色素瘤病人中获得，切除后立即存放到液氮中，-80℃保存，直至实验使用。所有病人或其近亲属知情同意，且本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂与细胞人皮肤黑色素瘤细胞株A375、A875、B16、SK-MEL-2和HEMa-LP均购自复旦大学细胞库；10%胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国Gibco公 司 ；小 干 扰RNA阴 性 对 照（si-NC）、LINC00662小干扰RNA（si-LINC00662）、miRNA抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）和miR-103a-3p抑制剂（anti-miR-103a-3p）购于上海吉玛公司；LipofectamineTM2000试剂盒均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、CCK-8试剂盒、RIPA缓冲液均购自上海碧云天生物科技有限公司；细胞周期蛋白1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（PCNA）和β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养与转染将解冻后的人皮肤黑色素瘤细胞株A375、A875、B16、SK-MEL-2和HEMa-LP分别接种于含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素于5%二氧化碳37℃条件下培养箱中进行孵育。取对数生长期A375细胞，接种到6孔细胞培养板中，密度为2.5×105，待细胞密度融合至70%～80%时，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书操作，分别将si-NC、si-LINC00662、anti-miR-NC和anti-miR-103a-3p转染至A375细胞。然后随机分四组：si-NC组、si-LINC00662组、si-LINC00662+antimiR-NC组 和si-LINC00662+anti-miR-103a-3p组。转染48 h后，检查转染效率。

1.4 qRT-PCR检测LINC00662和-miR-103a-3p表达水平按照Trizol法提取各组A375细胞的总RNA，测定浓度和纯度，按照逆转录试剂盒操作步骤进行合成cDNA，按照实时荧光定量PCR试剂盒步骤进行操作。LINC00662正向引物为：5'-TGGACATCTGTCTGGAGG-3'，反向引物为：5'-GGCTGAGGCATAAGAATCG-3'；β-actin正 向 引 物 为 ：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'；反向引物为：5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'；miR-103a-3p正向引物为：5′-ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGG-3′，反向引物为：5′-TGGTGTCGCGTGGAGTCG-3′；U6正 向 引 物 为 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 为 ：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。LINC00662和miR-103a-3p分别以β-actin和U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算LINC00662和miR-103a-3p表达水平。

1.5 CCK-8检测细胞增殖收集A375细胞，制备单细胞悬液，加入到96孔板中，5×103个/孔，并设置6个重复。分别在培养24 h、48 h、72 h时，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h。按照CCK-8试剂盒步骤进行操作，使用酶标仪在450 nm下检测光密度（OD）值。

1.6 流式细胞术检测细胞周期收集转染48 h后的A375细胞，用胰蛋白酶消化细胞，PBS重悬细胞，4℃静置24 h后，离心弃上清，PBS洗涤2次，1 000 μL PBS重悬，转管，室温下Annexin-V-FITC和PI进行染色15 min，流式细胞仪检测细胞周期情况。

1.7 Western blotting检测Cyclin D1、PCNA表达使用RIPA缓冲液试剂盒提取A375细胞的总蛋白，用BCA法检查蛋白的浓度。经10%SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h，取膜，4℃标记一抗过夜孵育，PBS清洗3次，1 h室温下进行二抗孵育，取膜。PBS清洗3次，加入ECL化学发光液，显色，曝光。计算分析Cyclin D1和PC-NA蛋白的相对表达量。

1.8 荧光素酶报告基因实验验证靶向关系将构建的LINC00662-WT（突变型）和LINC00662-MUT（野生型）载体，分别将miR-NC或miR-103a-3p转染到A375细胞。转染48 h后，收集细胞，加入裂解液，离心收集上清，使用双荧光素酶报告基因检查系统检测荧光速酶活性。

1.9 统计学方法所有试验数据均采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析与作图，数据表示均为3个独立实验的，两组间比较通过t检验，多组间比较通过单因素方差分析。通过Pearson分析两组之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00662在皮肤黑色素瘤的组织和细胞中的表达qRT-PCR结果显示，与正常组织1.24±0.50相比，皮肤黑色素瘤组织的LINC00662表达4.17±1.27，显著升高（t=10.95，P＜0.001），而人皮肤黑色素瘤 细 胞 株A375、A875、B16和SK-MEL-2中 的LINC00662的 表 达量（5.62±0.43、5.01±0.83、2.94±0.53、4.97±0.43）均 显著高于HEMa-LP细胞1.00±0.07（F=40.91，P＜0.001）。

2.2 沉默LINC00662对皮肤黑色素瘤细胞增殖和周期的影响结果显示，与si-NC组相比，si-LINC00662组的LINC00662表达、细胞增殖水平显著降低（表1）。流式细胞术检测结果显示，相较于si-NC组 ，si-LINC00662组G0/G1期 的 细 胞 比 例 增多、S期细胞比例减少。

表1 沉默LINC00662对细胞增殖的影响/

表1 沉默LINC00662对细胞增殖的影响/

组别si-NC si-LINC00662 t值P值重复次数3 3 LINC00662 1.00±0.06 0.48±0.06 10.61＜0.001 OD值0 h 0.29±0.04 0.28±0.04 0.31 0.775 24 h 0.52±0.03 0.38±0.04 4.85 0.008 48 h 0.71±0.05 0.50±0.08 3.86 0.018 72 h 0.84±0.04 0.59±0.07 5.37 0.006

Western blotting检测结果显示，与si-NC组相比，si-LINC00662组的Cyclin D1、PCNA蛋白表达显著降低，见表2，图1。

图1 各组细胞增殖相关蛋白表达

表2 沉默LINC00662对细胞周期和增殖相关蛋白表达的影响/

表2 沉默LINC00662对细胞周期和增殖相关蛋白表达的影响/

注：Cyclin D1为细胞周期蛋白1，PCNA为增殖细胞核抗原。

组别si-NC si-LINC00662 t值P值重复次数33 G0/G1 57.4±5.2 74.7±4.8 4.23 0.013 S 34.7±3.5 20.5±3.0 5.34＜0.001 G2/M 7.8±0.6 7.4±0.5 0.89 0.425 PCNA 0.99±0.05 0.53±0.06 10.20 0.001 Cyclin D1 1.00±0.01 0.56±0.06 12.53＜0.001

2.3 miR-103a-3p在黑色素瘤组织和细胞中的表达qRT-PCR检测显示，与正常组织1.17±0.32相比，黑色素瘤组织中的miR-103a-3p为0.64±0.21，明显降低（t=7.06，P＜0.001）；而人皮肤黑色素瘤细胞株A375、A875、B16和SK-MEL-2的miR-103a-3p的表 达 水 平（0.32±0.04、0.38±0.03、0.59±0.10、0.40±0.06）均 显 著 低 于HEMa-LP细 胞0.99±0.04（F=63.25，P＜0.001）。

2.4 LINC00662与miR-103a-3p靶向结合利用在线软件Starbase预测LINC00662与miR-103a-3p靶向结合位点（图2），双荧光素酶报告实验进一步验证其靶向关系，结果显示，miR-103a-3p显著降低了LINC00662-WT的萤光素酶活性，但对LINC00662-MUT的荧光素酶活性无明显影响（表3）。对LINC00662和miR-103a-3p进行相关分析，显示LINC00662和miR-103a-3p负相关。

图2 Starbase软件预测LINC00662与miR-103a-3p靶向结合位点

表3 双荧光素酶报告基因实验验证LINC00662与miR-103a-3p靶向关系/

表3 双荧光素酶报告基因实验验证LINC00662与miR-103a-3p靶向关系/

组别miR-NC miR-103a-3p t值P值重复次数3 3 LINC00662-WT 1.01±0.02 0.46±0.05 17.69＜0.001 LINC00662-MUT 0.99±0.07 0.99±0.06 0.00＞0.999

2.5抑制miR-103a-3p部分回复了沉默LINC00662对皮肤黑色素瘤细胞增殖和周期的影响qRT-PCR结果显示，si-LINC00662组的miR-103a-3p的表达明显高于si-NC组（表4）。与si-LINC00662+anti-miR-NC相 比，si-LINC00662+antimiR-103a-3p组的miR-103a-3p表 达 降低、G0/G1期细胞比例减少，细胞增殖水平升高、S期细胞比例增加以及Cyclin D1、PCNA蛋白表达也明显升高（图3，表5）。

表4 抑制miR-103a-3p逆转了沉默LINC00662对细胞的增殖作用/

表4 抑制miR-103a-3p逆转了沉默LINC00662对细胞的增殖作用/

注：①与si-NC组比较，P＜0.05。②与si-LINC00662+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

组别si-NC si-LINC00662 si-LINC00662+anti-miR-NC si-LINC00662+anti-miR-103a-3p F值P值重复次数3 3 3 3 miR-103a-3p 1.00±0.06 1.83±0.20①1.86±0.07 1.33±0.07②38.75＜0.001 OD值0 h 0.33±0.02 0.31±0.05 0.28±0.04 0.31±0.04 0.84 0.511 24 h 0.54±0.06 0.40±0.05 0.42±0.05 0.47±0.05 4.21 0.046 48 h 0.74±0.03 0.52±0.03①0.55±0.05 0.68±0.05②19.34 0.001 72 h 0.93±0.03 0.58±0.06①0.64±0.05 0.78±0.05②30.77＜0.001

表5 抑制miR-103a-3p逆转了沉默LINC00662对细胞周期和增殖相关蛋白表达的作用/

表5 抑制miR-103a-3p逆转了沉默LINC00662对细胞周期和增殖相关蛋白表达的作用/

注：PCNA为增殖细胞核抗原，Cyclin D1为细胞周期蛋白1。①与si-NC组比较，P＜0.05。②与si-LINC00662+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

组别si-NC si-LINC00662 si-LINC00662+anti-miR-NC si-LINC00662+anti-miR-103a-3p F值P值重复次数3333 G0/G1 55.8±2.4 70.1±3.2①71.1±4.1 59.2±1.8②19.74＜0.001 S 36.2±2.5 21.8±2.8①21.5±2.5 32.7±3.0②23.18＜0.001 G2/M 8.0±0.6 8.1±0.8 7.4±1.1 8.0±0.5 0.50 0.693 PCNA 1.00±0.05 0.51±0.05①0.48±0.06 0.69±0.08②45.60＜0.001 Cyclin D1 0.99±0.06 0.52±0.01①0.51±0.07 0.73±0.05②55.09＜0.001

图3 各组细胞增殖相关蛋白表达

3 讨论

皮肤黑色素瘤是由黑色素细胞中的黑色素生成的，是一种常见的恶性皮肤肿瘤，处于晚期的皮肤黑色素病人，目前尚无有效的治疗途径［16］。lncRNA在恶性黑色素瘤的细胞功能研究中起着至关重要的作用。有研究表明，抑制lncRNA TUG1表达能以抑制黑色素瘤细胞生长［17］。袁春蓉、刘勇宁［18］研究表明，SNHG3通过调节miR-186-5p，抑制黑色素瘤的生长。lncRNA-MEG3在黑色素瘤组织和细胞中表达下调，与不良的预后显著相关，通过miR-499-5p的过表达抑制了黑色素瘤细胞的增殖和细胞 周 期 阻 滞［9］，这 与 前 人 的 研 究 结 果［18］相 反 。LINC00662作为新发现LncRNA，有研究表明，通过Linc00662在前列腺细胞表达上调，可促进细胞的增殖［20］。王君莲等［11］研究表明，LINC00662通过miR-409-5p在宫颈癌中发挥着致癌作用。LINC00662在结肠癌中表达上调，高表达LINC00662通过上调miR-340-5p的表达，抑制结肠癌细胞的生长［21］。以上研究表明LINC00662在癌症中发挥着重要作用。

本研究结果表明，与正常组织和皮肤黑色素细胞，通过检测LINC00662表达量，发现皮肤黑色素瘤组织和细胞中高表达，表明LINC00662可能在皮肤黑色素瘤组织中发挥着一定的作用。进一步研究表明，沉默LINC00662的表达，与si-NC组相比，LINC00662表达水平降低，细胞增殖受到抑制，细胞G0/G1期的细胞比例增多、S期细胞比例减少，与增殖、周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达水平降低。lncRNA可以海绵吸附下游的miRNA，调控miRNA的表达进而影响肿瘤的发生与发展［22］。有研究表明，AGAP2-AS1通过调节下游miR-16-5p，促进肝癌的转移和复发［23］。为了进一步探究LINC00662在皮肤黑色素瘤中调控的下游靶基因，本研究通过在线预测软件和双荧光素酶实验验证了LINC00662与miR-103a-3p可以靶向结合，且呈负相关。有研究表明 ，LINC00662靶 向 调 控miR-497-5p表 达 ，抑 制LINC00662的表达可以抑制结直肠癌细胞生长，阻滞细胞周期［24］。在骨肉瘤的研究中，LINC00662表达上调，通过干扰LINC00662调控miR-15a-5p对骨肉瘤细胞的增殖、迁移等［25］。miR-103a-3p，也可称为miR-103，可以调节肿瘤细胞分子机制，如增殖、凋亡、周期等［26-27］。有研究表明，过表达miR-103a-3p可以抑制甲状腺癌细胞、肺癌细胞的生长和转移［14，28］。本研究结果发现，与正常组织和皮肤黑色素细胞，miR-103a-3p在皮肤黑色素瘤组织和细胞株中的表达下调，这与多人的研究结果一致，在此证实了miR-103a-3p在癌症中的抑癌作用。进一步实验证明，抑制miR-103a-3p可以逆转沉默LINC00662对皮肤黑色素瘤细胞的增殖、周期的影响，说明LINC00662可以通过调控miR-103a-3p的表达进而影响皮肤黑色素瘤中的作用。

综上所述，沉默lncRNA LINC00662的表达可以抑制皮肤黑色素瘤的增殖，以及细胞周期阻滞，其机制可能与miR-103a-3p有关，为皮肤黑色素的靶向治疗提供合理依据。