郭 帅，方 敬，郭立芳，王月华△，潘利敏△

(1.河北中医学院，石家庄 050091；2.河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室，石家庄 050091；3.河北省中医院，石家庄 050017)

随着人们饮食习惯、生活方式的改变，以及人口老龄化的影响，预计到2035年全球糖尿病患者的数量将从2013年的3.82亿人增加到5.92亿人[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见且严重的微血管并发症，已成为世界范围内引起终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因，也是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。早期有效防治DN是当今社会的热点和难点。

中医药是中华民族的瑰宝，在减轻DN患者临床症状、延缓疾病进展等方面具有独特的优势。基于DN气阴两虚、肾络瘀阻的基本病机，本课题组应用补阳还五汤合参芪地黄汤化裁治疗DN取得了较好的临床疗效。新近研究表明，肾小管间质纤维化是DN进展至ESRD的重要病理基础，而且比肾小球损伤更能预测肾脏疾病的进展[3]。肾小管上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是介导肾小管间质纤维化发生发展的关键环节[4]。Wnt/β-catenin信号通路在调控EMT过程中发挥着重要作用[5-7]。课题组先前的研究已经筛选出补阳还五汤合参芪地黄汤化裁干预DN的最佳中药剂量，并证明其疗效与阳性对照药物厄贝沙坦相当[8-10]。本研究拟通过高糖诱导HK-2细胞，体外模拟DN肾小管上皮细胞的病理环境，观察补阳还五汤合参芪地黄汤化裁含药血清对肾小管上皮细胞EMT及对Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的影响，以进一步阐释补阳还五汤合参芪地黄汤化裁对DN的治疗机制。本研究通过河北中医学院伦理委员会批准(批号2015-03)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠10只，体质量150～180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0006。大鼠饲养于河北中医学院动物房，温度20～25℃，湿度50%～70%，12 h/12 h光照/黑暗交替，通风良好，自由进食和饮水。

1.2 细胞

条件性永生化人近端肾小管上皮细胞(human proximaltubular epithelial cell line,HK-2)购自北京协和医学院基础医学细胞中心。

1.3 药物

黄芪(批号0093253)、当归(批号0093103)、赤芍(批号0113103)、桃仁(批号0096363)、地龙(批号0106443)、僵蚕(批号0090403)、蝉蜕(批号9126463)、太子参(批号0111323)、白术(批号0113073)、泽兰(批号0092583)、熟地黄(批号0101963)、山药(批号0090453)、牡丹皮(批号0113783)、山茱萸(批号0102693)均为中药颗粒剂，由广东一方药业有限公司生产，购自河北中医学院国医堂。

1.4 主要试剂及仪器

细胞增殖检测试剂盒(美国MedChemExpress公司，cell counting kit-8,CKK8，货号HY-K0301)；MEM 培养基(货号11095-080)、胎牛血清(货号10091-148)、青霉素/链霉素(货号15070-063)、胰酶-EDTA溶液，美国GIBCO公司，0.25%，含酚红，货号25200-056；浓缩型正常山羊封闭血清(货号AR1009)、荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司，货号BA1032；Triton X-100(上海碧云天生物技术有限公司，货号ST795)；钙黏附蛋白-E(E-cadherin，货号bs-1519R)、α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin alpha,α-SMA，货号bs-10196R)、Wnt4(货号BS6134R)、β-catenin(货号BS1165R)，北京博奥森生物技术有限公司；RIPA裂解液(北京索来宝科技有限公司,货号R0020)；ECL发光试剂盒(货号sc-2048)、山羊抗兔二抗(货号ZB2301)、β-actin(货号TA-09)，北京中杉金桥生物技术有限公司；PVDF膜(美国Millipore公司，货号IPVH00010)。

SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州集团安泰空气技术有限公司；MCO-15AC 型CO2恒温培养箱，日本SANYO公司；Flexstation 3型酶标仪，美国Molecular Devices公司；22331 hamburg型蛋白浓度定量仪，德国Eppendorf公司；GENESYS50型紫外分光光度计，美国Thermo Spectronic公司；DYCZ-24DN型电泳仪，北京六一生物技术有限公司；WSE-4040型半干转膜仪系统，美国Atento公司。

1.5 HK-2细胞培养

1.5.1 细胞复苏 HK-2细胞培养基：MEM培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素溶液。将HK-2细胞从液氮中取出快速放入37 ℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有5 mL培养基的离心管中，离心收集细胞；用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。

1.5.2 细胞传代 细胞的密度达到80%时对细胞进行传代。弃去培养基，PBS洗1次，加1～2 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞显微镜下观察，1～2 min后见细胞相互分离变圆即表示消化完成，快速弃去胰酶，加入完全培养基吹打细胞，制成单细胞悬液，按1∶3的比例传代，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下扩大培养。

1.6 药物血清制备

补阳还五汤合参芪地黄汤化裁成人临床使用剂量为：黄芪30 g，当归10 g，赤芍10 g，桃仁10 g，地龙12 g，僵蚕10 g，蝉蜕6 g，太子参15 g，茯苓15 g，白术10 g，泽兰10 g，熟地黄15 g，山药15 g，牡丹皮10 g，山茱萸10 g。按照人和大鼠体表面积法计算大鼠的给药剂量为黄芪2.7 g/(kg·d)，当归0.9 g/(kg·d)，赤芍0.9 g/(kg·d)，桃仁0.9 g/(kg·d)，地龙1.08 g/(kg·d)，僵蚕0.9 g/(kg·d)，蝉蜕0.54 g/(kg·d)，太子参1.35 g/(kg·d)，茯苓1.35 g/(kg·d)，白术0.9 g/(kg·d)，泽兰0.9 g/(kg·d)，熟地黄1.35 g/(kg·d)，山药1.35 g/(kg·d)，牡丹皮0.9 g/(kg·d)，山茱萸0.9 g/(kg·d)。

实验大鼠10只适应性喂养3 d，随机分为空白血清组5只和中药血清组5只。中药血清组大鼠给予中药补阳还五汤合参芪地黄汤化裁，空白血清组大鼠给予等体积饮用水，每日分2次灌胃，连续7 d。第7天2次灌胃间隔2 h，并于末次灌胃1 h后，称体质量、腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主动脉取血，将血清放入56 ℃水浴中灭活30 min，无菌细胞过滤器去除细菌，-20 ℃保存备用。

1.7 CKK8法筛选最佳药物血清浓度及干预时间

取处于对数生长期、生长状态良好的HK-2细胞，以2×103个/孔接入96孔板，同时设不含细胞的培养基为空白组，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS)；按照如下分组对细胞进行处理：HK-2细胞对照组，HK-2细胞+5%空白血清组，HK-2细胞+10%空白血清组，HK-2细胞+15%空白血清组，HK-2细胞+20%空白血清组，HK-2细胞+25%空白血清组 ，HK-2细胞+5%中药血清组，HK-2细胞+10%中药血清组，HK-2细胞+15%中药血清组，HK-2细胞+20%中药血清组，HK-2细胞+25%中药血清组，作用时间设置6 h、12 h、24 h及48 h。细胞培养至所需时间后每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培养4 h。酶标仪测定各孔450 nm吸光值(optical density,OD)。计算各组HK-2细胞增殖率：增殖率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%，实验重复3次。

1.8 分组

根据CCK8筛选出最佳空白血清和中药血清给药浓度均为10%，最佳干预时间为48 h，进行后续实验。细胞分组如下：正常组(葡萄糖5.5 mmol/L+10%空白血清)、对照组(葡萄糖5.5 mmol/L+10%中药血清)、模型组(葡萄糖30 mmol/L+10%空白血清)、中药组(葡萄糖30 mmol/L+10%中药血清)，各组细胞干预48 h行后续指标检测。

1.9 免疫荧光法检测HK-2细胞中E-cadherin及α-SMA的表达

在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室温通透滴加正常山羊血清封闭，滴加稀释好的一抗(E-cadherin 1∶25，α-SMA 1∶100)4 ℃孵育过夜。PBST浸洗后滴加稀释好的荧光二抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h。滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)避光孵育5 min，对标本进行染核。用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下采集图像。

1.10 Western blot法检测HK-2细胞中Wnt4及β-catenin的表达

取1×106个细胞加入100uL RIPA裂解液，4 ℃冰箱过夜。离心取上清调整蛋白浓度，变性、电泳、转膜。5%脱脂奶粉封闭后，4 ℃加一抗(Wnt4 1∶600，β-catenin 1∶800)孵育过夜，37 ℃加二抗(1∶3000)孵育1 h，ECL发光试剂盒显色。扫描胶片，Image J软件测定条带灰度值。以目的条带与β-actin灰度值的比值来表示蛋白相对表达量。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 各干预时间(12 h、24 h、48 h)不同浓度大鼠血清对HK-2增殖率的影响

表1示，根据CCK8法筛选出最佳空白血清和中药血清给药浓度均为10%，最佳干预时间为48 h。

表1 各干预时间不同浓度大鼠血清对HK-2增殖率影响比较

2.2 各组HK-2细胞形态变化比较

倒置显微镜下观察各组HK-2细胞形态，正常组HK-2细胞呈“鹅卵石”铺路状且排列紧密；对照组HK-2形态较正常组无明显变化；模型组HK-2细胞变成长梭形，细胞间隙变大；中药组HK-2细胞形态及密度有一定逆转(见图1)。

图1 各组HK-2细胞形态的变化(倒置显微镜×100)

2.3 各组HK-2细胞中E-cadherin及α-SMA表达比较

免疫荧光结果显示，正常组E-cadherin主要分布在细胞膜和细胞浆，而α-SMA在细胞浆中有少量表达。与正常组比较，对照组中E-cadherin和α-SMA的表达无明显变化。与正常组比较，模型组中E-cadherin表达减少，而α-SMA表达增多。中药血清处理后，E-cadherin表达增多，而α-SMA表达减少，提示中药血清可以抑制高糖诱导HK-2细胞的EMT(见图2)。

2.4 各组HK-2细胞中Wnt4及β-catenin表达的比较

Western blot结果显示，与正常组比较，对照组Wnt4及β-catenin的表达量差异无统计学意义(P>0.05)，模型组Wnt4及β-catenin的表达量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，中药组Wnt4及β-catenin的表达量均显著减少(P<0.01)，提示中药血清可以抑制高糖诱导的HK-2细胞中Wnt/β-catenin信号通路激活(见图3)。

注：钙黏附蛋白-E(E-cadherin)；α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin alpha,α-SMA)图2 各组HK-2细胞中E-cadherin及α-SMA表达比较(免疫荧光×200)

注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01图3 各组HK-2细胞中Wnt4及β-连环蛋白(β-catenin)表达

3 讨论

补阳还五汤合参芪地黄汤化裁治疗DN是基于中医理论对DN的认识及全国名老中医赵玉庸教授“肾络瘀阻”学说[11]，并结合多年临床经验提出的。本课题组认为DN的基本病机为气阴两虚、气虚无力运血则血行迟缓，日久可致血瘀；阴虚火旺，煎熬津液，则津亏血少，血液黏稠不畅，日久而致痰凝、血瘀，病久不愈深伏于肾络渐成微小癥积，致使肾体受损，肾用失司、肾失封藏、精微渗漏导致DN的发生。补阳还五汤出自清代医家王清任所著《医林改错》，由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花和桃仁组成，具有补气、活血、通络之功效，是益气活血法的代表方剂，也是临床治疗慢性肾脏疾病的常用方。参芪地黄汤源于清代医家沈金鳌编撰的《沈氏尊生书》，由人参、黄芪、熟地黄、牡丹皮、茯苓、泽泻、山药、山茱萸组成，具有益气养阴、补肾健脾的功效，为益气养阴之要药。补阳还五汤合参芪地黄汤化裁是在补阳还五汤和参芪地黄汤基础上去川芎、红花，加僵蚕、蝉蜕以增强入肾络搜剔之效，加白术以助黄芪健脾益气之功而成。以补阳还五汤合参芪地黄汤化裁治疗DN可谨守病机，抓住主症，行益气、养阴、活血、消癥、通络之功。

肾小管间质纤维化是DN进展至ESRD的关键环节。目前认为，EMT是肾小管间质纤维化发生发展的重要机制[4]。近年来人们普遍认为肌成纤维细胞是产生细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要细胞[12]，而肌成纤维细胞的来源主要是肾小管上皮细胞发生EMT。研究证实，在肾纤维化过程中，高达36%的肌成纤维细胞来源于局部肾小管上皮细胞EMT[13]。EMT包括肾小管上皮细胞失去其上皮表型(如E-cadherin)，肾小管基底膜破坏，部分肾小管上皮细胞进入肾间质，获得间充质表型(如α-SMA)而转变成肌成纤维细胞。同时，这一过程中包含着肾小管上皮细胞形态的改变及极性的消失[14，15]。高血糖是DN基本的代谢特征，是诱导EMT的主要因素之一。本研究通过高血糖诱导HK-2建立DN模型，与正常组比较，对照组HK-2细胞形态、E-cadherin和α-SMA的表达无明显变化，说明补阳还五汤合参芪地黄汤化裁本身对细胞无毒副作用；模型组HK-2细胞形态改变，E-cadherin表达减少，α-SMA表达增多，提示HK-2细胞发生了EMT。补阳还五汤合参芪地黄汤化裁血清可以在一定程度上改善肾小管上皮细胞EMT。

肾小管上皮细胞EMT是一个复杂的动态过程，涉及多种细胞因子及多条信号通路[16-18]。Wnt/β-catenin信号通路是介导肾小管上皮细胞EMT的主要途径。在生理情况下，Wnt/β-catenin信号通路在调控细胞分化、增殖、凋亡和迁移中起关键作用[19]。在DN中，Wnt/β-catenin信号通路被激活，β-catenin磷酸化被阻断，泛素降解减少，转位到细胞核与转录因子结合，调节Snail和Twist等靶基因的转录，从而抑制E-cadherin的表达并增加纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白的表达，促进EMT的发生[20，21]。另外研究表明，Wnt/β-catenin信号通路可以与Notch1/Jagged-1、细胞外信号调节激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/smad、Janus蛋白酪氨酸激酶2(janus kinase 2,JAK2)/信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38 MAPK)等信号通路相互作用，共同促进EMT的发生和进展[22-24]。Wnt-4是Wnt家族的重要成员，对于EMT的发生起着重要作用。在本研究中，与正常组比较，模型组Wnt/β-catenin信号通路显著激活。补阳还五汤合参芪地黄汤化裁血清可以显著降低Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。

综上所述，本研究采用体外实验证实了补阳还五汤合参芪地黄汤化裁能改善肾小管上皮细胞EMT，其机制可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。