潘海春 祁大庆 陈琳慧 汪玲羽

胃癌的特征是在胃壁内生长癌细胞，虽然与其他类型的癌症相比，胃癌相对罕见，但这种疾病最大的危险因素之一是诊断困难。因为胃癌通常不会引起任何早期症状，所以通常在扩散到身体其他部位后才被确诊，这使得治疗更加困难[1]。中国胃癌每年新发病例约为68万例，占全球发病病例的一半左右，且大部分患者诊断时已为进展期胃癌[2]。当上消化系统内正常健康的细胞发生癌变，生长失控形成肿瘤时，就会发生胃癌。这个过程发生得很慢，因此胃癌往往会发展多年[3]。有很多因素可能会增加患胃癌的风险，包括某些其他疾病，例如：淋巴瘤、幽门细菌感染、消化系统其他部位的肿瘤、胃息肉等[4]。晚期胃癌最常见的症状有：恶心呕吐、频繁的胃灼热、食欲不振，有时伴有突然的体质量减轻、持续性腹胀、早饱、血便、黄疸、过度疲劳、胃痛等[5]。胃癌的主要治疗方法有：化疗、放射治疗、外科手术、免疫治疗、疫苗和药物治疗等[6]。5-氟尿嘧啶是嘧啶类的氟化物，属于抗代谢、抗肿瘤药，能有效抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷酸，又能干扰DNA合成，同时也一定程度的抑制RNA。临床常用于胃癌、肝癌、直肠癌、结肠癌等的治疗[7, 8]。

细胞的凋亡与氧化应激密切相关，在正常情况下,机体内ROS的产生和ROS清除系统处于动态平衡状态，其他外源和内源因素诱导时会平衡破坏，大量的活性氧来不及清除会产生细胞毒性而对人体产生伤害，有研究表明，活性氧的氧化应激也是胃癌凋亡的因素之一[9，10]。

胃复春胶囊是一种用于治疗胃部疾病的中成药，主要对恶心、呕吐、反酸、嗳气、胃胀、胃痛、食欲不振等临床症状有治疗效果，临床上可用于胃癌的辅助治疗[11,12]。本研究通过细胞凋亡和抗氧化水平的检测来研究胃复春胶囊提取物对5-氟尿嘧啶诱导的人胃癌细胞凋亡的促进作用的相关机制，研究胃复春胶囊的提取物在胃癌中细胞的氧化应激和凋亡的作用影响，从而为胃复春联合抗癌药物在胃癌的辅助治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器UV-3600Plus分光光度计(岛津企业管理有限公司)；厌氧工作站 Concept 1000(北京隆福佳生物科技有限公司)；DYY-6D三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)； BD FACSCanto II 流式细胞仪(上海碧迪医疗器械有限公司)；TSX40086A 超低温冰箱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；W5L-1恒温水浴槽(杭州瑞诚仪器有限公司)；BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；MLS-3751L高压蒸汽灭菌锅(松下健康医疗器械株式会社)；Stab S2可叠加式全温振荡培养箱(上海润度生物科技有限公司)Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Eppendorf-5424小型高速离心机(艾本德中国有限公司)。

1.2 试验用药品与试剂胃复春胶囊(国药准字Z20090697，杭州胡庆余堂有限公司)；5-氟尿嘧啶、DMSO、注射用青霉素钠及注射用硫酸链霉素(美国Sigma公司)；胎牛血清、DMEM(美国HyClone公司)；胰蛋白酶(美国Gibico公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；噻唑蓝(MTT)试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；细胞浆蛋白抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；实验所用抗体包括Bax、Bcl-2和GAPDH(均购买自美国Cell Signaling Technology公司)；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒(Bender公司)；细胞浆蛋白抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；蒸馏水由Milli-Q超纯水系统制得；盐酸、碳酸氢钠、乙醚均为分析纯(购自北京化工厂)；其他试剂(分析纯)(北京试剂厂)。

1.3 方法

1.3.1 细胞株及培养人胃癌细胞株MGC-803购买自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)。将胃癌细胞培养于PMI1640培养液(100 μg/ml链霉素、100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清)中，置于37 ℃湿度饱和的细胞培养箱内(含5% CO2，95%空气)，取对数生长期的细胞接种于24孔细胞培养板(5×105个/ml密度)中，每孔1 ml，置于培养箱(37 ℃、5%CO2)中恒温培养。

1.3.2 抑制细胞增殖的实验取MGC-803胃癌细胞(1×105/ml)分别接种于96孔板(200 μl/孔)，每孔加入终浓度为0、50、100、200 nmol/L的5-氟尿嘧啶或0、50、100、200 μg/ml的胃复春胶囊提取物。以同体积PMI1640培养液为空白对照。各质量浓度均设5个复孔，分别继续培养24 h，吸去药液，在37 ℃下每孔加入MTT试剂100 μl，继续孵育4 h，用分光光度计在OD=590 nm处测定各孔吸光度值(A)。空白对照组细胞的活力计为100%，计算各处理组细胞的相对活力(×100%)。以细胞活力下降到对照的50%时所对应的药品浓度计为半抑制浓度(IC50)。

1.3.3 检测细胞凋亡及细胞周期将MGC-803胃癌细胞(1×105/ml)接种于6孔培养板内，分别加入0、50、100、200 μg/ml的胃复春胶囊提取物和终浓度为50 nmol/L的5-氟尿嘧啶，细胞培养24 h后收集并离心，再加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，室温避光反应15 min，筛网过滤后送流式细胞仪检测细胞凋亡。另取各孔细胞，PBS洗涤2次，用冰浴预冷的70%乙醇于4 ℃固定24 h，PBS洗涤2次，加入PI染色液，避光染色30 min，使用流式细胞仪分析细胞周期。

1.3.4 Western blot检测蛋白表达量的变化MGC-803细胞以50 nmol/L的5-氟尿嘧啶、100 μg/ml的胃复春胶囊提取物处理24 h后，收集细胞，参照试剂盒说明书进行细胞浆蛋白抽提操作，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜上，以GAPDH分别作为内参，然后ECL发光液显色，观察各条带深浅变化。

1.3.5 细胞SOD MDA和GSH-Px测定50 nmol/L的5-氟尿嘧啶、100 μg/ml的胃复春胶囊提取物MGC-803细胞处理24 h后，按组别收取细胞培养上清液，按MDA、SOD、GSH-Px试剂盒说明书操作，测定细胞培养液上清中的MDA、SOD、GSH-Px含量。

2 结果

2.1 5-氟尿嘧啶及胃复春胶囊提取物对胃癌细胞活力的影响不同浓度的5-氟尿嘧啶处理细胞24 h后，MGC-803细胞株活力显著降低，并具有浓度依赖性，其中50 nmol/L的5-氟尿嘧啶处理后，细胞活力大约下降了50%，其半抑制浓度为51.25 nmol/L。见表1。经过50 nmol/L的5-氟尿嘧啶和不同浓度胃复春胶囊提取物共同处理24 h、48 h、72 h后，MGC-803细胞株活力均有所下降，且随着胃复春胶囊提取物浓度的升高和处理时间的增加，同步对细胞活力的下降作用也逐渐增强，呈浓度和时间依赖效应。见表2。

表1 5-氟尿嘧啶对MGC-803细胞活力的影响

表2 胃复春胶囊提取物对5-氟尿嘧啶处理的胃癌细胞活力的影响

2.2 胃复春胶囊提取物对5-氟尿嘧啶诱导的胃癌细胞凋亡的促进作用流式细胞仪检测结果显示，胃复春胶囊提取物能抑制胃癌细胞凋亡。胃复春胶囊提取物(终浓度为100μg/ml)处理胃癌细胞24 h后，细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)为23.70%，5-氟尿嘧啶(50 nmol/L)处理的细胞凋亡率为20.33%。5-氟尿嘧啶和胃复春胶囊提取物共同处理的细胞，细胞凋亡率显著增加，达到43.02%，明显高于5-氟尿嘧啶单独处理组。见图1。

图1 胃复春胶囊提取物对5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡的促进作用

2.3 5-氟尿嘧啶及胃复春胶囊提取物对胃癌细胞内与细胞凋亡相关的蛋白表达量的影响通过Western blot测定发现，经过5-氟尿嘧啶处理后MGC-803细胞中，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达量上调；在胃复春胶囊与5-氟尿嘧啶组，胃癌细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达量随着剂量增加持续上调。见图2。

图2 胃复春胶囊提取物及5-氟尿嘧啶联用对与细胞凋亡相关蛋白表达量的影响

2.4 5-氟尿嘧啶及胃复春胶囊提取物对胃癌细胞中SOD MDA和GSH-Px的影响与对照组培养细胞上清液比较，采用黄嘌呤氧化酶法于550 nm处对SOD活力的测定结果显示，5-氟尿嘧啶处理使胃癌细胞中SOD酶活性有所降低(P>0.05)，胃复春胶囊提取物与5-氟尿嘧啶联用处理组胃癌细胞SOD酶活性降低比较明显(P<0.05)；采用TBA法(532 nm)测定MDA含量的结果显示：5-氟尿嘧啶处理使胃癌细胞中MDA含量明显升高，胃复春胶囊提取物与5-氟尿嘧啶联用处理组MDA含量明显升高(P<0.05)；5-氟尿嘧啶处理使胃癌细胞中GSH-Px活性显著降低，而胃复春胶囊提取物与5-氟尿嘧啶联用处理后细胞上清液中GSH-Px活性进一步降低(P<0.05)。见表3。

表3 胃复春胶囊提取物及5-氟尿嘧啶联用对胃癌细胞中SOD MDA和GSH-Px的影响 (n=5)

3 讨论

腹部肿瘤可能是一个严重的威胁生命的问题。事实上，胃癌是最致命的癌症之一，这主要是因为直到疾病发展到相当严重时才出现明显的症状。目前，手术、化疗和放疗是胃癌最常见的治疗方法。胃癌手术可能需要切除全部或部分胃，附近的淋巴结也可能需要切除。切除部分胃的手术可能会缓解晚期胃癌患者的癌症症状和体征。化疗是一种利用化学物质杀死癌细胞的药物治疗。化疗药物遍布全身，杀死可能扩散到胃以外的癌细胞[13]。5-氟尿嘧啶虽然临床应用很多，但是也有大量的不良作用，例如：胃肠道反应经常会出现腹痛、恶心呕吐、食欲不振等症状，严重者有血性腹泻或便血。此外还有骨髓抑制、脱发、皮肤和指甲色素沉着等[14]。与化疗药物相比，天然产物在胃癌的治疗中具有安全性高、不良作用小的优点。目前已报道了多种具抗肿瘤作用的天然产物对胃癌的作用，包括在体外对胃癌细胞系的研究或在体内对胃癌动物模型的研究，也有少量的临床试验[15]。许多天然化合物可以通过诱导细胞周期阻滞或诱导胃癌细胞凋亡而抑制胃癌生长。天然物质的另一用途是联合疗法，即2种或2种以上的物质或一种天然产物与常规化疗药物联合用药。一些天然化合物可能对传统的细胞毒疗法敏感，增强药物的有效浓度，增强2种药物的联合作用或对肿瘤细胞产生特异性的细胞毒作用。此外，通过靶向多种信号通路的联合治疗，利用各种机制来减少抗肿瘤药物的耐药性[16]。胃复春是中药复方制剂，临床上主要用于防治慢性萎缩性胃炎及胃癌前病变，已有多年应用的历史。但是胃复春治疗胃癌癌前病变的作用机制尚不明确。

细胞凋亡(Apoptosis)是以核DNA断裂为标志的细胞自我毁灭的遗传导向过程，通过刺激物的存在或抑制剂或刺激物的去除而被激活，是消除DNA受损、多余或不需要的细胞的正常生理过程，当停止(如基因突变)可能导致细胞异形增生和肿瘤形成，故又称为程序性细胞死亡(PCD)，细胞凋亡是人体的本身具有的生理机制，在人体内环境的稳定中发挥重要作用[17,18]。本研究发现5-氟尿嘧啶可引起MGC-803细胞凋亡，而不同浓度的胃复春胶囊提取物可以促进由5-氟尿嘧啶诱导引起的细胞凋亡，表明胃复春胶囊提取物与5-氟尿嘧啶联用，可以促进5-氟尿嘧啶致凋亡的作用。

据报道在细胞凋亡过程中Bcl-2家族蛋白的激活也起到重要作用[19]。胃复春胶囊提取物与5-氟尿嘧啶联用处理的MGC-803细胞中可以进一步上调Bax的表达量，下调Bcl-2的表达量。猜测可能是通过调节Bcl-2家族蛋白活性从而促进细胞凋亡。有文献表明机体内氧化应激(Oxidative stress)是ROS的产生和清除处在失衡状态的表现[20]。此次研究中发现胃复春胶囊提取物增强氧化应激水平，对5-氟尿嘧啶处理的胃癌细胞的促进凋亡作用可能与它的氧化还原功能有关。

综上所述，在5-氟尿嘧啶处理的胃癌细胞中，胃复春胶囊的提取物可以对抗凋亡蛋白的表达进行抑制，对促凋亡蛋白分子进行增强，同时促进胃癌细胞的凋亡。此次研究的结果对胃复春胶囊进一步研究对胃癌术后的辅助作用提供理论依据。