潘翱，陈静*，赖舒

（重庆市九龙坡区人民医院药剂科，重庆 400050）

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis,AIT）是获得性甲状腺功能减退的主要原因，占所有自身免疫性疾病的30%[1]。AIT的特征是淋巴细胞浸润导致甲状腺滤泡破坏。在临床实践中，AIT的治疗主要依赖于非特异性抗甲状腺药物、免疫抑制剂和抗炎剂，然而疗效不佳和副作用明显等缺点限制了这些药物的临床应用[2]，因此，迫切需要新的治疗方法。

考虑到中药的疗效、低副作用和低成本的特点，中药是潜在的治疗AIT的一种替代疗法。柴胡皂苷A（saikosaponin A, SSa）来源于柴胡，具有抗炎、抗氧化和调节免疫的作用[3]，可能也对AIT有治疗作用。几十年来，实验性自身免疫性甲状腺炎（experimental autoimmune thyroiditis, EAT）模型已被证明是研究AIT的理想模型，一直被用来模拟人类AIT[4]。因此，本研究通过注射佐剂乳化的猪甲状腺球蛋白（porcine thyroglobulin, pTG）和摄入过量碘建立EAT大鼠模型，然后给予SSa干预，研究SSa对AIT的影响并分析其初步的机制。

材料和方法

1 试剂

SSa（HPLC≥98%）购自成都普非德生物技术有限公司；pTG购自武汉纯度生物科技有限公司；弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA）和弗氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant, FIA）购自德国MERCK公司；HE染色液和DAPI染色液（5 μg/mL）购自北京雷根生物技术有限公司；兔抗Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain containing protein 3, NLRP3）、兔抗凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC）、兔抗裂解胱天蛋白酶-1（Cleaved Caspase-1）（Ala317, p10）和兔抗白细胞介素‐1β（interleukin‐1β, IL‐1β）一抗购自美国Affinity公司；羊抗兔IgG-HRP和羊抗兔IgG-SAlexa Fluor 488购自北京索莱宝科技有限公司；生物素标记的羊抗兔IgG和链霉亲和素-过氧化物酶工作液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody, TgAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody, TPOAb）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）、游离三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine, T3）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor‐α, TNF‐α）和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）等大鼠酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒购自江苏酶免实业有限公司。

2 实验动物和分组处理

24只6~7周龄雌性SD大鼠（体重180~200 g）购自重庆医科大学实验动物中心[SCXK（渝）2018-0003]。将大鼠置于特定的无病原体条件下饲养，并随机分为3组：对照组、EAT组、EAT+SSa组，每组8只。根据文献[5]所述方法进行诱导EAT大鼠模型，除对照组外，EAT+SSa组和EAT组的大鼠通过在多部位（背部、腹部、颈部和足垫部）皮下注射FCA乳化的pTG（100 μg/0.2 mL）进行免疫，第2~6周每周多部位皮下注射注射FIA乳化的pTG（100 μg/0.2 mL）加强免疫一次，期间饮用含0.05%碘化钠的饮用水；第7~10周每天腹腔注射20 mg/kg SSa[6]或等量生理盐水。对照组在第1~6周每周皮下注射0.2 mL生理盐水，第7~10周每天腹腔注射等量生理盐水。

3 ELISA分析

给药方案结束后，取次日空腹10 h的大鼠的尾静脉血，并分离血清。按照试剂盒说明书步骤，用ELISA法检测血清中TgAb、TPOAb、TSH和T3的水平。

同时，对大鼠进行深度麻醉后并处死，收集甲状腺组织。每只大鼠取0.1 g甲状腺组织，用1 mL无菌生理盐水匀浆后，收集匀浆液并按照试剂盒说明书步骤，用ELISA法检测甲状腺组织中TNF‐α和IL-6的水平。

4 HE染色

将甲状腺组织用4%多聚甲醛固定后，包埋在石蜡中，然后制备4 μm厚的切片。切片脱蜡至水后，用HE对甲状腺组织切片进行染色，并按照Chen等[7]方法对EAT严重程度进行定量评分，用1~5的等级评分来评估EAT的严重程度：1分，一个或几个浸润病灶，覆盖少于25%的腺体；2分，10-20个细胞浸润灶，覆盖25%的腺体；3分，25%~50%的腺体被浸润；4分，50%~75%的腺体被浸润的炎性细胞破坏；5分，甲状腺腺体完全破坏。

5 免疫组织化学染色

取4 µm厚的石蜡包埋的甲状腺组织切片，依次经脱蜡、再水化、3% H2O2处理10 min后，将组织切片浸入柠檬酸缓冲液并在微波炉中90 ℃至98 ℃下加热12 min来修复抗原。切片用10%山羊血清封闭30 min，然后用TNF‐α一抗（1:200）4℃孵育过夜，漂洗后加入生物素标记的羊抗兔IgG（1:200）二抗，37 ℃孵育30 min；漂洗后加入链霉亲和素-POD过氧化物酶（1:200）37 ℃孵育30 min。漂洗后进行DAB显色，然后用苏木精复染。切片在在光学显微镜（BX53，OLYMPUS，日本）下观察并拍照。

6 免疫荧光染色

取4 µm厚的石蜡包埋的甲状腺组织切片，依次经脱蜡、再水化、3% H2O2处理10 min后，抗原修复后，将切片与NLRP3一抗（1:500）在4 ℃孵育过夜，漂洗后，加入羊抗兔IgG-SAlexa Fluor 488（1:500）37 ℃避光孵育1 h。漂洗后，用DAPI复染并在荧光显微镜（TE2000-E，尼康，日本）下观察并拍照。

7 Western blot

用RIPA提取甲状腺组织中蛋白，然后用BCA法将蛋白定量后，取等量的蛋白（10 µL样品中含30 µg蛋白）在10% SDS-PAGE上分离并转移到聚偏氟乙烯膜上；用5%牛血清白蛋白封闭蛋白转移膜30 min，并在4 ℃下与NLRP3（1:1000）、ASC（1:1000）、Cleaved Caspase-1（1:1000）和IL‐1β（1:1000）和GAPDH（1:5000）分别孵育过夜；TBST漂洗膜，室温下与羊抗兔IgG-HRP（1:1000）孵育60 min；TBST漂洗膜，用化学发光底物试剂显色并通过化学发光蛋白印迹成像仪（上海易孛特光电技术有限公司）成像并测定条带光密度值。

8 统计学方法

所有数据均表示为均数±标准差（x±s）。用GraphPad Prism 9软件进行统计并输出统计柱状图。多组数据之间差异使用单向方差分析，组间均数两两比较用Bonferroni事后检验。P<0.05被认为差异具备统计学意义。

结 果

1 SSa降低EAT大鼠的自身免疫性甲状腺炎严重程度

HE染色显示，对照组甲状腺组织正常，甲状腺滤泡较大且滤泡腔内充满胶质，滤泡上皮和滤泡间未见单核细胞浸润；EAT组表现为中重度甲状腺炎，许多甲状腺滤泡破坏、萎缩、滤泡上皮细胞崩解成碎屑聚集在滤泡腔，部分滤泡上皮细胞和滤泡间可见明显的炎性细胞浸润，部分未见炎性细胞浸润的滤泡腔内胶质变少，另外部分间质间可见纤维组织增生，甲状腺炎严重程度评分显著高于对照组；EAT+SSa组大鼠甲状腺炎的严重程度评分较EAT组显著降低，组织学损伤也得到一定的改善（包括炎性细胞浸润减轻，滤泡形态转良，泡腔内胶质增多）（图1）。

图1 SSa减轻EAT大鼠自身免疫性甲状腺炎的病理严重程度。A，HE染色观察大鼠甲状腺炎的组织学变化；B，甲状腺炎严重程度评分统计学分析：与Con组相比，###P<0.001；与Model组相比，**P<0.01；n=8Fig. 1 Alleviation effects of SSa on the severity of autoimmune thyroiditis in EAT rats. A, HE staining to observe the histological changes of rat thyroiditis; B, statistical analysis for severity score of thyroiditis. ###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs Model group; n=8

2 SSa降低EAT大鼠血清TPOAb、TgAb和T3水平

ELISA检测显示：与甲状腺炎严重程度评分结果相似，与对照组相比，EAT组大鼠血清TPOAb、TgAb和T3显著升高，EAT+SSa组大鼠血清TPOAb、TgAb、T3水平较EAT组显著降低（图2）。

图2 SSa对EAT大鼠血清TPOAb（A）、TgAb（B）和T3（C）水平影响的ELISA检测与统计学分析。与Con组相比，###P<0.001；与EAT组相比，**P<0.01；n=8Fig. 2 ELISA detection and statistical analysis for the effect of SSa on the levels of TPOAb (A), TgAb (B) and T3 (C) in the serum of the EAT rats.###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs EAT group; n=8

3 SSa降低EAT大鼠甲状腺组织中的炎性细胞因子水平

对甲状腺组织进行免疫组织化学染色显示：对照组大鼠的甲状腺组织无TNF‐α免疫反应性；EAT组TNF‐α主要表达于滤泡上皮，呈强阳性；EAT+SSa组大鼠甲状腺组织中TNF‐α免疫反应性强度和分布范围均较EAT组明显减少（图3A）。ELISA分析显示，EAT+SSa组大鼠的甲状腺组织中TNF‐α和IL-6水平均显著低于EAT组（图3B）。

图3 SSa对EAT大鼠甲状腺组织中炎性因子表达的影响。A，甲状腺组织中TNF‐α表达水平的免疫组织化学检测。B，甲状腺组织中TNF‐α水平ELISA检测与统计学分析；C，甲状腺组织中IL-6水平的ELISA检测与统计学分析；与Con组相比，###P<0.001；与EAT组相比，**P<0.01；n=8Fig. 3 Effect of SSa on the expression levels of inflammatory factors in the thyroid tissues of EAT rats. A, immunohistochemical examination of TNF‐α expression in the thyroid tissues; B，ELISA detection and statistical analysis for the TNF‐α level in rat thyroid tissues; C, ELISA detection and statistical analysis for the IL-6 level in rat thyroid tissues; ###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs EAT group; n=8

4 SSa抑制EAT大鼠甲状腺NLRP3炎症小体激活

免疫荧光染色和Western blot检测SSa对炎症体激活的作用显示：与对照组相比，EAT组大鼠甲状腺中NLRP3的免疫染色信号增加，NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1和IL‐1β水平显著升高，而EAT+SSa组上述蛋白表达显著低于EAT组（图4），表明提示EAT大鼠甲状腺中NLRP3炎症小体被激活，SSa能抑制EAT大鼠甲状腺中NLRP3炎症小体的激活。

图4 SSa对EAT大鼠甲状腺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响。A，甲状腺组织NLRP3免疫荧光染色代表性图像。B，甲状腺组织中NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1和IL‐1β表达水平的代表性Western blot检测结果；C—F，甲状腺组织中NLRP3（C）、ASC（D）、Cleaved Caspase-1（E）和IL‐1β（F）相对表达水平的统计学分析；与Con组相比，###P<0.001；与EAT组相比，**P<0.01；n=8Fig. 4 Effect of SSa on the expression of NLRP3 inflammasome associated proteins in the thyroid tissues of the EAT rats. A, representative images of thyroid NLRP3 immunofluorescence staining; B, Western blotting to detect the expression levels of NLRP3, ASC, Cleaved Caspase‐1 and IL‐1β in the thyroid tissues; C to F, statistical analysis for the relative expression levels of NLRP3 (C), ASC (D), Cleaved Caspase‐1 (E) and IL‐1β (F) in the thyroid tissue. ###P<0.001 vs Con group; **P<0.01 vs EAT group; n=8

讨 论

AIT也称为桥本氏甲状腺炎，是最常见的自身免疫疾病之一，是成人甲状腺功能减退的头号病因[1]。EAT模型已被证明是研究AIT的理想模型[4]。本研究通过皮下注射佐剂乳化的pTG联合过量碘摄入建立EAT大鼠模型，证明了SSa能减轻EAT大鼠的甲状腺滤泡损伤并降低血清中的TgAb、TPOAb、TSH和T3浓度，提示SSa在治疗AIT的潜在有效性。

越来越多的研究显示NLRP3炎症小体在AIT的发病和发展中起着至关重要的作用。在AIT患者甲状腺组织中中观察到NLRP3、ASC、Caspase-1、IL‐1β和IL-18的mRNA和蛋白表达上调[8,9]。过量碘摄入通过激活甲状腺滤泡细胞中的NLRP3炎症体而促进AIT的发展[9]。一项研究探讨了炎症小体与AIT之间的联系，并揭示了AIT患者甲状腺组织中NLRP3和IL‐1β水平与血清TPOAb和TgAb水平呈正相关[10]。另外，已有研究表明下调NLRP3/Caspase-1通路可改善大鼠的EAT[11]。因此，本研究中关注NLRP3炎症体的作用，发现EAT大鼠甲状腺中NLRP3、ASC、Cleaved Caspase1和IL‐1β蛋白表达增加，提示NLRP3炎症的激活，而SSa成功地逆转了这些蛋白质的表达，反映出SSa在EAT中的有益效果至少部分归因于抑制了甲状腺中的NLRP3炎症。

总之，目前的研究表明，SSa治疗对EAT大鼠的自身免疫性甲状腺炎有显著的有益作用，这可能是由于其抑制了EAT大鼠甲状腺肿NLRP3炎症小体的激活。另外，本研究为SSa治疗自身免疫性甲状腺炎提供了临床前证据。