刘斌*，刘向阳，詹新立，王国平

（1湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院脊柱外科，长沙 410005；2广西医科大学第一附属医院脊柱骨病科，南宁 530021）

骨肉瘤（osteosarcoma, OS）是一种好发于儿童和青少年的常见的原发性恶性骨肿瘤，其发病率在所有类型的原发性骨肿瘤中排名第一[1]。骨肉瘤恶性程度高，易早期发生远处转移，很多患者确诊时已经发生转移或者进入晚期，因此临床治疗困难。目前，尽管骨肉瘤患者的5年生存率得到了较大提高，但远期生存率仍处于较低水平。因此，深入研究骨肉瘤增殖及转移相关的分子机制、探索新的治疗靶点，具有重要的临床意义。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是指长度在200~100000 nt的无编码功能的RNA，近年来的研究发现LncRNA在多种肿瘤的病理机制中发挥了重要的作用[2-4]。

本研究利用GEO数据库中骨肉瘤患者的临床数据，采用生物信息学方法分析筛选出与致病相关的LncRNA，继而用骨肉瘤细胞系MG63及U2OS进行细胞实验，探索骨肉瘤增殖迁移的分子机制，为靶向治疗提供理论基础。

材料与方法

1 材料

人成骨细胞系HfoB1.19和骨肉瘤细胞株MG63、U2OS（武汉普诺赛生命科技公司）；Mc-Coy’5A培养基（武汉普诺赛生命科技公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；1%双抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）、胰蛋白酶（武汉普诺赛生命科技公司）；CCK-8检测试剂盒（东仁化学科技公司）；兔抗SphK1抗体（Abcam公司）、兔抗Caspase-3抗体（Proteintech公司）、兔抗mTOR抗体（Proteintech公司）、兔抗p-mTOR抗体（Affinity公司）、小鼠抗GAPDH抗体（普健生物科技公司）和辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；人肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）特异性siRNA（si-MALAT1）及对照siRNA (si-NC)（上海吉玛公司）；RNA提取试剂盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，Takara公司）；反转录试剂盒（Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser perfect Real time, Takara公司）；荧光定量试剂（light cycler 480 SYBR Green I Master, Roche公司）；凋亡检测试剂盒A211-02（南京诺唯赞生物科技公司）。

2 生物信息学分析

使用R软件对原始数据集GSE14359进行差异基因的筛选和数据可视化，筛选标准为FDR<0.05 &|logFC|>2。从GEO数据库下载GSE21257数据集的芯片数据（有生存信息的骨肉瘤样本53例），利用R语言survminer package进行MALAT1的生存分析。

3 细胞培养及转染

用含有10%灭活胎牛血清和双抗的DMEM/F12培养基培养细胞，隔天换液，所有细胞置于37℃（成骨细胞HfoB1.19，34℃），含5% CO2的培养箱中培养。利用脂质体转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Reagent将si-NC、si-MALAT1转染至骨肉瘤细胞，转染4~6h后更换新鲜完全培养基。细胞分组包括：骨肉瘤细胞组、HfoB1.19组、NC siRNA组和LncRNA-MALAT1 siRNA组。

4 总RNA提取及实时荧光定量PCR

收集各组细胞，按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书进行总RNA提取。采用逆转录酶试剂盒将RNA反转录成cDNA后，进行RT-qPCR。其反应程序如下：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，10 s，退火60 ℃，15 s，延伸72 ℃，20 s，共40个循环，采用2−ΔΔCT法计算基因的相对表达水平。所用到的PCR引物序列见表1。

表1 PCR的引物序列Tab. 1 Primer sequences for PCR

5 CCK-8法检测细胞增殖

各组细胞以5000个/孔（96孔板）进行铺板，每组3个重复，5% CO2，37 ℃过夜培养。转染后分别培养1 d、2 d、3 d、4 d后，每孔加入CCK8试剂， 37 ℃孵育4 h后加入终止液，再用全功能微孔板检测仪检测450 nm波长下的吸光度值（OD450）。

6 细胞划痕实验

用于检测细胞的迁移能力。培养板接种细胞之前先用记号笔在6孔板背面画横线标记；细胞消化后接入6孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜；细胞铺满板底后，用10 µL枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致；吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片，加入相应培养基，拍照记录；将培养板放入培养箱培养，0 h、6 h、24 h、48 h分别取出拍照；根据收集图片数据分析结果。

7 细胞周期检测

转染48 h后收集骨肉瘤细胞，PBS洗涤，加入70%乙醇4 ℃固定过夜。再次PBS洗涤、去除乙醇，加入DNA染液碘化丙啶（PI）并上机检测。细胞周期检测用流式细胞仪（CytoFLEXS）进行分析，数据用软件CytExpert 2.3进行收集和分析。

8 细胞凋亡检测

细胞凋亡检测按照凋亡检测试剂盒A211-02 的说明书进行操作。siRNA转染后收集骨肉瘤细胞并用PBS洗涤；加结合缓冲液稀释，取100 μL重悬；加入5 μL Annexin V-FITC；加入5 μL PI，室温避光15 min；再补加150 μL Binding Buffer后上机检测。

9 Western Blot检测蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白的浓度，根据裂解液的体积加入5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min。然后用10%的SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上；用含5%奶粉的TBST封闭1 h后，PVDF膜在抗SphK1（1︰1000）、抗Caspase-3（1︰1000）、抗p-mTOR（1︰500）或抗GAPDH（1︰5000）一抗中4 ℃孵育过夜。第二天用PBST洗涤3次后，将PVDF膜放入稀释的HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG（1︰5000）中室温孵育1 h。最后用ECL显像，用ChemiDoc™XRS+凝胶成像系统观察结果，GAPDH 作内参。

10 统计学分析

每组数据至少重复3次，结果用均数±标准差表示。采用SPSS 22.0进行统计学分析，组间比较用ANOVA检验法分析，P<0.05具有统计学意义。

结 果

1 MALAT1在骨肉瘤中高表达并与生存预后呈负相关

从GEO数据库下载GSE14359数据集的芯片数据（非转移骨肉瘤数据10例，正常样本2例），对GSE14359进行差异表达分析，并绘制火山图和热图，结果发现与正常样本相比，共有536个基因在骨肉瘤中差异表达，其中299个基因表达上调，237个基因表达下调（图1A，B）。MALAT1的表达明显增高（图1C）。从GEO数据库下载GSE21257数据集的芯片数据（有生存信息的骨肉瘤样本53例），进行MALAT1的生存分析。结果表明，MALAT1的表达量与骨肉瘤患者的生存预后呈负相关，即表达量越高、患者生存预后越差（图1D）。

图1 骨肉瘤差异基因分析及MALAT1的生存分析。A，骨肉瘤差异基因热图分析；B，骨肉瘤差异基因火山图分析；C，MALAT1在骨肉瘤及正常组织中的表达比较；D，MALAT1的Kaplan-Meier生存分析Fig. 1 Differential gene analysis of osteosarcoma and survival analysis of MALAT1. A, heat map analysis of differential genes in osteosarcoma; B,volcanic map analysis of differential genes in osteosarcoma; C, expression of MALAT1 in osteosarcoma and normal tissues; D, Kaplan‐Meier survival analysis of MALAT1.

2 骨肉瘤细胞系中MALAT1高表达

为了探索骨肉瘤细胞中MALAT1表达的变化情况，本研究比较了骨肉瘤细胞系和成骨细胞系中MALAT1的表达量。RT-qPCR检测显示，与成骨细胞HfoB1.19相比，骨肉瘤细胞系MG63及U2OS中MALAT1的表达均明显升高（图2A）。Si-MALAT1组骨肉瘤细胞中MALAT1的表达明显低于空白组及阴性对照组，证明SiRNA成功抑制了MALAT1的表达（图2B）。

图2 RT-qPCR检测骨肉瘤细胞中MALAT1表达水平。A，成骨细胞及骨肉瘤细胞中MALAT1表达水平的统计学分析；与HfoB1.19组比较：**P<0.01，n=3。B, Si-MALAT1对骨肉瘤细胞系中MALAT1表达的影响；与空白组及阴性对照组比较：**P<0.01，n=3Fig. 2 RT-qPCR determination of MALAT1 expression level. A, statistical analysis of MALAT1 expression level in osteoblasts and osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with HfoB1.19 group; n=3. B, effect of Si‐MALAT1 on MALAT1 expression in osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with blank group or negative control group; n=3

3 MALAT1促进骨肉瘤细胞增殖

为了明确MALAT1表达水平与骨肉瘤细胞增殖的关系，应用CCK-8法比分析了MALAT1表达对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。结果显示，与Si-NC组相比， Si-MALAT1处理的MG63细胞增殖能力明显受抑制（图3A），在U2OS骨肉瘤细胞系中有相似结果（图3B）。由此说明MALAT1具有促进骨肉瘤细胞增殖的能力。

图3 MALAT1对骨肉瘤细胞增殖影响的CCK-8法分析。A, 抑制MALAT1表达对MG63骨肉瘤细胞增殖能力的影响；与si-MALAT1组比较：**P<0.01；n=3。B，抑制MALAT1表达对U2OS骨肉瘤细胞增殖能力的影响；与si-MALAT1组比较：**P<0.01；n=3Fig. 3 The effect of MALAT1 on the proliferation of osteosarcoma cells. A, effect of MALAT1 inhibition of MALAT1 expression on the proliferation of MG63 osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with si‐MALAT1 group; n=3. B, effect of MALAT1 inhibition of MALAT1 expression on the proliferation of U2OS osteosarcoma cells; **P<0.01 as compared with si-MALAT1 group; n=3

4 MALAT1增强骨肉瘤细胞的迁移能力

为了明确MALAT1表达水平与骨肉瘤细胞迁移能力的关系，应用划痕实验分析了抑制MALAT1表达对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。结果显示，与成骨细胞HfoB1.19相比，骨肉瘤细胞系MG63及Si-NC组48 h后划痕愈合更明显，表现出更强的迁移能力；敲除MALAT1后的Si-MALAT1组骨肉瘤细胞的迁移能力明显减弱（图4A）；在U2OS骨肉瘤细胞系中表现出类似结果（图4B）。由此表明，MALAT1可增强骨肉瘤细胞的迁移能力。

图4 MALAT1对骨肉瘤细胞迁移影响的划痕实验分析。A，抑 制MALAT1表 达 对MG63骨肉瘤细胞迁移能力的影响；B，抑制MALAT1表达对U2OS骨肉瘤细胞迁移能力的影响。比例尺，100 μmFig. 4 The effect of MALAT1 on the migration of osteosarcoma cells. A, scratch testing for effect of inhibition of MALAT1 expression on the migration ability of MG63 osteosarcoma cells; B. effect of inhibition of MALAT1 expression on the migration ability of U2OS osteosarcoma cells. Scale bar, 100 μm

5 MALAT1抑制细胞凋亡降低细胞G0/G1期百分比

应用流式细胞术比较了抑制MALAT1表达对骨肉瘤细胞周期及凋亡的影响。结果显示，与空白对照及阴性对照组相比，敲除MALAT1后MG63和U2OS骨肉瘤细胞凋亡比率明显增加（图5A-C），G0/G1期百分比显著升高（图5D，E）。由此表明，MALAT1可抑制骨肉瘤细胞凋亡，促进其增殖。

图5 MALAT1对骨肉瘤细胞周期及凋亡影响的流式细胞术分析。A，凋亡率代表性流式细胞术检测结果；B和C，抑制MALAT1表达对MG63和U2OS骨肉瘤细胞凋亡率影响的统计学分析。D，细胞周期代表性流式细胞术检测结果；E和F，抑制MALAT1表达对MG63和U2OS骨肉瘤细胞周期影响的同统计学分析。与NC si-MALAT1组比较：*P<0.05；**P<0.01；n=3Fig. 5 Flow cytometry analysis for effect of MALAT1 on cell cycle and apoptosis of osteosarcoma cells. A, representative flow cytometry analysis of apoptosis rate; B and C, statistical analysis for the effect of MALAT1 expression inhibition on the apoptosis of MG63 and U2OS osteosarcoma cells.D, representative flow cytometry analysis of cell cycle; E and F, statistical analysis for the effect of MALAT1 expression inhibition on the cell cycle of MG63 and U2OS osteosarcoma cells. *P<0.05 and **P<0.01 as compared with NC si-MALAT1 group; n=3

6 MALAT1降低Caspase-3表达升高SphK1和pmTOR表达

为了进一步明确MALAT1与骨肉瘤细胞凋亡的关系，应用Western blot技术检测了MALAT1表达对骨肉瘤细胞凋亡相关蛋白水平的影响。结果显示，抑制骨肉瘤细胞MG63及U2OS中MALAT1表达可使激活型Caspase-3水平明显升高，而SphK1和p-mTOR水平显著降低， p-mTOR/mTOR比例降低（图6，7）。这些结果提示MALAT1可通过降低Caspase-3水平、升高SphK1和p-mTOR水平抑制骨肉瘤细胞凋亡。

图6 MALAT1对骨肉瘤细胞MG63与凋亡相关蛋白水平影响的Western blot分析。A, 抑制MALAT1表达对MG63骨肉瘤细胞中Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平影响的代表性Western blot检测结果。B，Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平的统计学分析；与NC si-MALAT1组比较：**P<0.01（n=3）Fig. 6 Western blot detection for the effect of MALAT1 on the expression of apoptosis related proteins in the osteosarcoma MG63 cells. A, representative results of Western blot analysis of the levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR. B, statistical analysis of levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR; **P<0.01 as compared with NC si-MALAT1 group (n=3)

讨 论

近年来的研究表明，LncRNA在表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多层面对肿瘤的发生、发展起重要的调控作用。对LncRNA的表达调控可以改变肿瘤的生物学行为，因此LncRNA可作为肿瘤生物治疗的潜在靶点。人肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）与多种肿瘤的发生、发展及转移相关[5,6]。MALAT1失调在骨肉瘤中也有报道[7]，骨肉瘤中MALAT1表达上调，可通过不同信号通路调控骨肉瘤的增殖、侵袭、转移等行为[7-10]，是骨肉瘤预后的一个独立影响因素[11]。但是，MALAT1对于骨肉瘤调控的具体分子机制尚未完全明确，MALAT1对骨肉瘤凋亡相关基因表达的影响还未见报道。

本研究通过分析GEO数据库，发现包括MALAT1在内的多种LncRNA在骨肉瘤中高表达，并与患者的生存率密切相关，提示MALAT1可能在骨肉瘤增殖转移中发挥了调控作用。细胞实验中，敲除MALAT1后与对照组细胞进行比较，结果表明，与HfoB1.19成骨细胞相比，骨肉瘤细胞中MALAT1表达明显升高，MALAT1可促进细胞增殖、迁移并抑制细胞凋亡；而敲除MALAT1可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移，并增加细胞凋亡。这些结果都表明，MALAT1能促进骨肉瘤的恶性行为。

图7 MALAT1对骨肉瘤细胞U2OS与凋亡相关蛋白水平影响的Western blot分析。A, 抑制MALAT1表达对MG63骨肉瘤细胞中Caspase-3、水平抑制MALAT1表达对U2OS骨肉瘤细胞中Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平影响的代表性Western blot检测结果。B，Caspase-3、SphK1、mTOR及p-mTOR水平的统计学分析；与NC si-MALAT1组比较：**P<0.01（n=3）Fig. 7 Western blot detection for the effect of MALAT1 on the expression of apoptosis related proteins in the osteosarcoma U2OS cells. A, representative results of Western blot analysis of the levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR in the osteosarcoma U2OS cells. B, statistical analysis of levels of Caspase-3, SphK1, mTOR and p-mTOR; **P<0.01 as compared with NC si-MALAT1 group ( n=3)

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的、有序的死亡。正常状态时，机体内的细胞增殖及凋亡处于平衡状态，但肿瘤组织中凋亡受抑制，使肿瘤细胞能在机体内增殖、扩散。Caspase-3、SphK1、mTOR、p-mTOR在细胞凋亡调控中发挥了重要的作用。本研究表明，敲除MALAT1能促进凋亡相关蛋白Caspase-3的表达，抑制SphK1和p-mTOR的表达，并降低p-mTOR/mTOR比例。说明MALAT1过表达可能是通过调控凋亡相关通路、抑制骨肉瘤细胞凋亡，进而促进其增殖和迁移的。肿瘤的发生发展是一个多因素参与的复杂过程，MALAT1对骨肉瘤的生物学行为的影响有待于进一步从动物水平及更深入的分子水平进行研究。

综上所述，MALAT1能通过调控凋亡相关通路、抑制细胞凋亡，促进骨肉瘤细胞增殖迁移等生物学行为，并与骨肉瘤患者的临床生存率密切相关，可作为骨肉瘤靶向治疗的潜在生物靶点。