马龙，董娟，夏梦，孟慧，蔡令波，刘嘉茵

(南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心，南京 210029)

随着生育计划的推迟及我国 “三孩政策”的全面开放，越来越多的高龄女性有生育要求。但高龄女性在体外受精(IVF)周期中对促性腺激素(Gn)反应不良，导致获卵数少、周期取消率高及临床妊娠率低[1-2]。有学者提出，对卵巢低反应周期常规使用卵胞浆内单精子注射(ICSI)，以期减少常规IVF的受精失败及相应的较少可移植胚胎数的影响，进而改善临床结局[3]。在过去的二十年里，ICSI的应用显著增加，尤其在非男性因素不孕的患者，但 ICSI是将精子直接注射到卵母细胞胞浆内，规避了自然的选择过程，而且作为一种有创性的操作，可能会对卵母细胞造成损伤，所以在高龄、非男性因素不孕的女性中采用ICSI的受精方式仍存在争议[4-5]。本文回顾性分析分别行IVF和ICSI的高龄患者的临床资料，比较两种受精方式的差异，探讨ICSI能否改善非男性因素不孕高龄患者的助孕结局，以期为临床治疗提供依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2018年1月至2020年12月在本中心行IVF/ICSI治疗的非男性因素不孕患者的临床资料。

纳入标准：(1)非男性因素不孕行IVF/ICSI助孕治疗；(2)患者年龄38～46岁；(3)获卵数≥1枚。

排除标准：(1)≥4次的IVF/ICSI周期；(2)前次IVF周期受精失败或受精率<30%的周期；(3)PGT周期；(4)供卵周期；(5)睾丸穿刺或附睾穿刺周期。

初期共收集3 735个周期，剔除32个补救周期(本中心大部分获卵数≤3枚周期不行短时受精，故不予补救)、精子因素不符合入组标准596个周期。本研究共纳入3 107个周期，包括2 876个IVF周期(IVF组)和231个ICSI周期(ICSI组)。

二、研究方法

1.精液分析：根据世界卫生组织(WHO)人类精液检查与处理实验室手册第五版标准[6]，男性患者的精液参数均需满足以下条件：精子总数≥39×106，浓度≥15×106/ml，前向运动精子比率≥32%或总活率≥40%，精子正常形态≥4%。

2.取卵受精：对IVF/ICSI周期患者B超监测卵泡生长发育情况，当2个优势卵泡直径≥18 mm或4个优势卵泡直径≥16 mm时肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)10 000 U，36～38 h后在B超引导下，使用18 G取卵针(Cook公司，澳大利亚)，在110 mm压力下经阴道穿刺取卵。卵母细胞培养2～3 h即HCG后39～40 h进行IVF/ICSI受精。

3.胚胎评分：按照Veeck卵裂期胚胎评分标准[7]，依据第3天胚胎发育速度、卵裂球数目、细胞质均一性及碎片多少等进行胚胎分级。其中卵裂球数目≥7、碎片≤10%的胚胎为优质胚胎；卵裂球数目≥4、碎片≤15%的胚胎为Ⅲ级以上的可移植胚胎；卵裂球数目<4、碎片>15%的胚胎为Ⅳ级废弃胚胎。

4.胚胎移植：卵母细胞受精后，胚胎发育至第3天在B超引导下使用专用移植管(Cook公司，澳大利亚)行宫腔内移植。

5.观察指标：移植后第14天检查血清β-HCG水平，第35天B超检查确认孕囊和胎心，发现孕囊者判定为临床妊娠。妊娠不足28周，胎儿体重小于1 000 g而终止妊娠者视为流产。孕满28周且至少有1个存活新生儿分娩定义为活产。IVF正常受精率=(D1出现2PN及2PB卵母细胞数)/获卵数×100%；ICSI正常受精率=(D1出现2PN及2PB卵母细胞数)/MⅡ卵母细胞数×100%；IVF异常受精率=(多PN+1PN)数/获卵数×100%；ICSI异常受精率=(多PN+1PN)数/MⅡ卵母细胞数×100%；受精失败率=受精失败周期数/总周期数×100%；2PN卵裂率=2PN卵裂数/2PN数×100%；可移植胚胎率=可移植胚胎数/正常受精胚胎数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

两组患者的平均年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、子宫内膜厚度均无统计学差异(P> 0.05)；ICSI组基础FSH(bFSH)值显著低于IVF组(P<0.05)，ICSI组抗苗勒管激素(AMH)水平、窦卵泡数(AFC)及获卵数均显著高于IVF组(P<0.05)(表1)。

表1 两组患者一般情况比较

二、两组患者实验室指标比较

两组患者的完全受精失败率、2PN卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率均无统计学差异(P> 0.05)；ICSI组正常受精率显著高于IVF组、异常受精率显著低于IVF组(P<0.05)(表2)。

表2 两组患者的受精及胚胎发育情况比较(%)

三、两组患者临床结局比较

IVF组和ICSI组分别有1 343和102个周期进行了胚胎移植。统计结果显示，两组患者的临床妊娠率、流产率、活产率均无统计学差异(P> 0.05)(表3)。

表3 两组患者临床结局比较(%)

讨 论

随着ICSI在生殖领域的发展，在非男性因素不孕的高龄患者中的应用逐渐增加，但尚无充足证据表明ICSI可以改善临床结局。

由于高龄患者获卵数少，增加了完全受精失败的风险，特别是当男方精液质量正常时，如何最有效地利用有限的卵母细胞，避免完全受精失败，选择常规IVF受精还是ICSI受精就成了临床实践中的一个难题。一些回顾性研究比较了非男性因素不孕高龄患者IVF与 ICSI周期的结果显示，ICSI改善了高龄患者的临床结局，提高了妊娠率[4，8]。也有研究指出，对于非男性因素不孕高龄患者，ICSI周期的临床结果并不优于常规IVF周期[5，9-12]。最近的一项Meta分析比较了ICSI 周期与常规IVF周期在38岁以上非男性因素不孕患者中受精率的差异，结果显示，ICSI受精方式并不能提高高龄患者卵母细胞受精率[13]。对这些回顾性研究相互矛盾结果的可能解释是，胚胎学家选择高龄患者的卵母细胞进行ICSI或常规IVF受精的决定并不是随机的，胚胎学家可能会倾向于选择更“成熟”的卵母细胞进行ICSI，经验丰富的胚胎学家可以根据颗粒细胞的扩散程度，准确判断出卵母细胞的成熟度和质量[14]。

本研究对非男性因素的高龄患者的受精方式及其结局进行了回顾性分析。本研究中，ICSI组患者bFSH、AFC、获卵数等基础条件略优于IVF组，受精结果显示，ICSI组的正常受精率高于IVF组，异常受精率低于IVF组，但两组受精失败率、可移植胚胎率、优质胚胎率等实验室指标相当。提示对于非男性因素不孕的高龄患者，ICSI在有效利用卵母细胞、避免完全受精失败方面并不存在优势，其并不能提高胚胎质量；同时，IVF组和ICSI组的临床妊娠率、流产率、活产率均相当，并无显著差异，说明若无明确男性因素，对于高龄患者，ICSI并不能改善其临床结局。

ICSI是一种具有侵入性的技术，它会破坏卵胞膜和细胞器，导致卵母细胞退化或胚胎发育潜能下降[15]。一项评估ICSI技术对临床结局影响的前瞻性研究显示，卵母细胞退化率在5%～11%，并且实施该试验的实验室技术人员之间也存在较大差异[16]。此外，ICSI绕过了受精过程的大部分步骤，胚胎学家在选择形态正常的活动精子时，不能确定精子上有无碎裂或变性的DNA，所以不可避免会选到异常精子的风险，这可能导致胚胎不着床或妊娠后出现早期流产[17]。这也许可以解释在本研究中，尽管ICSI组的正常受精率较IVF组高，但仍然无法获得较高的优胚率、妊娠率和活产率。

在就受精方式向不孕患者提供咨询时，应充分告知ICSI的安全性和额外增加的费用。在最近的一项大型队列研究中，包括308 974例出生婴儿，其中ART助孕出生婴儿6 163例，研究结果显示，非ICSI技术出生的ART助孕婴儿出生缺陷率与自然妊娠相似，然而，ICSI周期的婴儿出生缺陷风险明显增加[18]。目前关于ICSI技术对子代发育以及健康状况的研究还存在不足，ICSI技术的安全性还需要进一步的验证[19-21]；同时ICSI的治疗费用相对更高，加重了不孕患者的经济负担，也使不孕患者再次治疗的依从性下降。

本研究中ICSI周期数相对较少，可能对研究结果有一定的影响。以后的研究中需要进一步扩大样本量，并对非男性因素高龄患者受精方式进行随机对照试验(RCT)相关研究，比较IVF与ICSI受精方式的差异。

综上所述，对非男性因素不孕高龄患者来说，从有效利用卵母细胞、改善助孕结局来看，应用ICSI并不比常规IVF更具有优势。