严慧玲， 郭新波， 刘金钏

（华南理工大学轻工与食品国家级实验教学示范中心，广东 广州 510640）

0 引言

培养具有创新意识和创新能力的高素质人才，是目前各高校人才培养的共同追求。在人才培养的过程中，实验教学是其中的重要组成部分。通过实验教学，可以培养学生发现及解决问题的能力，激发其创新意识，养成严谨的科学态度。在提高学生学术综合素养的同时，实现高等教育内涵发展，提升人才培养质量， 强化学生实践能力和创新思维的目标。

由于学时有限等原因，实验课程内容安排欠合理是目前本科实验教学面对的一大难题。为了完成教学内容安排，大部分高校的实验课程按照“一门实验跟一门课程”的模式进行教学。如《食品微生物实验》对应《食品微生物学》课程，主要讲述食品中微生物各项指标的检测。此外，不同实验课程的教学内容比较孤立，各实验项目之间相互独立。即使是综合性实验，综合的一般都是本门理论课程中的各个知识点，与其他课程的内容交叉甚少甚至完全独立[1]。

为了提高实验课的教学效果，巩固学生所学的知识，让学生熟悉与掌握实践性较强的技术，在食品生物化学实验课程中引入科研实验室常用的叶酸含量测定实验，同时融合了微生物相关的知识点。旨在通过叶酸含量测定的实验，将维生素的性质、酶的应用、微生物培养等知识内容结合在一起，从叶酸的提取、菌种活化到接种、培养、含量测定，将食品生物化学实验课重新编排，以叶酸的提取及含量测定作为教学模块，形成具有连贯性的教学内容。

1 叶酸含量测定综合性实验设计

1.1 基本思路

食品生物化学实验是食品专业本科生重要的专业基础课，根据专业培养目标及课程设置要求，针对营养类综合性设计性实验进行了探索和实践[2-3]。基本思路：以建设食品科学一流学科为目标，更多地体现学科特色，充分考虑到课程的衔接性和延续性，尽可能将零散的知识点串联在一起，综合目前科研实验室常用的实验方法和技术，激发和培养学生对本专业的热情及科研参与积极性，增强学生灵活应用理论知识解决实际问题的意识和能力。

叶酸含量测定的综合性实验涵盖了微生物学、分析化学、食品生物化学3 门课程。由于实验涉及的知识点较多，为使学生能够更好地理解操作步骤，将对应知识点进行归纳总结，如表1 所示[4-5]。

表1 实验步骤及对应知识点Tab. 1 Experimental steps and knowledge points

1.2 菌种的选择

酪乳酸杆菌（ATCC 7469） 、粪链球菌（ATCC 8043）是叶酸需求菌，其生长状况和所处环境中叶酸的含量高低具有极强的相关性[6-7]。在一定条件下，酪乳酸杆菌和粪链球菌的繁殖速度与叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以吸光度值计，通过与标准曲线相比较，能计算出样品中叶酸的含量。国标GB 5 009.211－2014采用酪乳酸杆菌（ATCC 7 469）作为检测菌，但因其检测限低、培养时间长，不适合用于本科教学，故选用粪链球菌作为本实验的叶酸检测菌[8-10]。

2 实验安排

考虑到本科实验的难度及深度，叶酸含量测定综合性实验在本科第4 学期开设。此时学生已完成分析化学、有机化学、无机化学、微生物等课程的学习，具有一定的实验基础。为了保证实验顺利进行，让学生从基础性实验到综合性实验有一个较好的过渡，将叶酸含量测定综合性实验设置为半开放实验：即将实验分成两部分，叶酸的提取为开放部分，由学生自行查找文献以确定方法；叶酸含量的检测为给定部分，教师提供既定的方法。实验室根据学生的实验方案向其提供实验所需的试剂及设备。

2.1 实验材料及试剂

市面上常见果蔬、谷物类及营养强化剂型样品均可，材料由学生自带。

实验用菌种：粪链球菌（Streptococcus faecalis, S.F.ATCC 8 043）。

提供学生实验方案涉及的所有试剂。

2.2 实验步骤

2.2.1 检测菌悬液的制备

菌种的复苏：从甘油管中挑取小部分菌液，用平板划线法得到单菌落；用接种环挑取ATCC8043 平板上一颗单菌落，接种至装有30 mL 已灭菌的脑心浸液肉汤培养基的50 mL 无菌离心管中，轻轻旋上盖子，置于37 °C 摇床培养4 h 至肉眼可见溶液变浑浊即可。

菌悬液的制备：菌种复苏完毕后，8 000 r/min 离心2 min，在无菌环境中，倒去上清液，添加30 mL 0.85%无菌生理盐水，重悬菌体，8 000 r / min 离心2 min。重复以上步骤3 次以清洗菌体，最后加入一定量的生理盐水重悬菌体，在660 nm 下调整光密度至0.8 左右，即得到实验用菌悬液，需现配现用。

2.2.2 叶酸的提取

常用的叶酸提取方法包括单酶法和三酶法[11-16]。针对不同的食品种类，叶酸的提取方法略有不同，此部分设置为开放实验，样品的预处理及提取由学生自行查阅文献确定，教师提供其所需试剂。为消除试剂本身所含叶酸对实验结果的影响，按照同样的提取方法准备一支空白管，样品部分以等质量的超纯水代替。

1.1.1 细胞 SiHa、Hela、MS751人宫颈癌细胞、HcerEpic人正常子宫颈上皮细胞，均购自中国科学院上海细胞库。

2.2.3 叶酸含量的测定

（1）标准曲线的绘制。

取15 mL 离心管按照0～9 号进行标记，向每支管中分别加入5 mL 叶酸测定培养基，于0～9 号管分别加入叶酸标准工作液（2 ng/mL）：0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00、2.50 和3.00 mL，用超纯水补至5 mL，于121 °C 灭菌20 min 后冷却，在无菌操作的条件下，吸取50 μL 生理盐水菌悬液至每支测定离心管中，于37 °C 摇床中培养18～20 h。将培养完毕后的离心管置于4 °C 冰箱中静置15～30 min。以0 号管为参比，于660 nm 处测量吸光值，记录数据。以标准系列管中叶酸含量为自变量（x），吸光度值为因变量（y），绘制标准曲线。

（2）测定。

取15 mL 离心管分别标注样品管及空白管，每孔分别加入5 mL 叶酸测定培养基，于样品管、空白管分别加入100 μL 样品提取液（实际加样体积应按照样品具体情况进行调整）、100 μL 空白对照提取液（具体体积应与样品管相等），用超纯水补至5 mL。接种及培养方法同上。测各样本生长后在660 nm 处的吸光值，由标准曲线换算样品中叶酸含量。

2.3 结果计算

试样中叶酸含量计算公式为

3 具体实施及经验总结

不同于以往的实验，叶酸综合性实验知识点较多且实验的连贯性强，若实验操作的其中一个环节出现纰漏，则容易导致实验结果误差大，甚至失败。所以教师在实验过程中的引导作用尤为重要，具体流程如图1所示。

图1 实验流程Fig. 1 Experimental process

为了取得更好的教学效果，采取小班分组的方式进行教学，每个教师指导3～4 组学生，学生以2 人为单位组成一个小组，单独完成实验报告。为了让实验更连续，摒弃了“一周一次课，一次4 学时”的传统教学时间安排，改为连续的“两天12 学时”的时间安排，让学生更多地参与实验过程。由于本项目支持学生重复实验，若学生无法在规定时间内完成，则可以在课后与教师预约，另行安排时间完成。

在样品的选择上设置了开放环节，由学生根据自己的兴趣自带样品进行实验，如西红柿、奶粉、维生素强化剂等。如何对样品进行预处理，称取多少样品进行实验，这些都需要学生查阅文献后确定。实验室给每组学生提供试剂，而溶液的配制及样品的处理均由学生自行完成。

比较学生绘制的标准曲线，发现以半开放形式开展本实验，得到的数据具有较好的稳定性。以标准系列管中叶酸含量为x值， 吸光度值为y值，绘制一阶方程得到R2>0.960 的标准曲线；按照唐靓等[16]的方法绘制4 阶方程，则R2≥0.999，线性拟合良好。

实验完成后，要求学生以小论文的形式提交报告，撰写严格按照华南理工大学本科毕业论文格式的要求。小论文的撰写需要学生查阅大量的文献，累计一定的知识，形成自己的实验思路。除了课堂上的有限学习时间，促使学生充分利用课后时间，改变应试教育模式，让学生学以致用，扩大知识面。教师以引导者的身份引导学生完成整个实验，及时解答学生在实验过程中出现的各种问题，通过提问的方式启发学生找到问题原因，并解决问题。不同于其他实验，本实验过程允许出错，支持学生重复实验，培养学生养成锲而不舍的科研精神。

4 结束语

自2018 年开始在本科食品生物化学实验教学中实施以来，叶酸含量测定综合性实验获得了学生的一致好评。因该实验项目与现实生活贴近，实验选材为生活中常见的食品，学生表现出较高的兴趣，大大提高了学习的主动性。以学生为主、教师为辅的教学模式，充分锻炼了学生的创新意识和探索精神。学生自行组队，查阅相关文献，独立提出实验方案和实验计划，自主实验、分析实验数据，并撰写实验论文。连贯性较强，避免了基础性实验存在的知识点分散等问题，让学生对实验的整个流程更加清晰，有利于其对现行检测方法的掌握。小班教学、小组配合，可以加深学生对基础理论知识的理解，提高基本实验技能，增强分析问题、解决问题的能力，培养严谨的科学思维方法、逐步建立探索创新意识，又能培养团队合作精神，为今后进入科学研究领域奠定坚实的基础。

该实验方法简单，对设备要求不高，但综合性强，具有一定的广度及深度，适合作为食品专业的综合性实验在各高校中开展。