王永芳 王 斌 王效春

糖尿病、高血压、慢性肾脏病(CKD)患者在使用碘对比剂(CM)后发生急性肾损伤(AKI)的风险增加。近期美国放射学会发布的专家共识将对比剂相关的急性肾损伤(CA-AKI)定义为CM注射后48 h内所发生的任何AKI[1-3]。除水化之外,目前临床上尚无有效的防治措施[4],因此,寻找防治CA-AKI的药物具有重要临床意义。

研究表明,CA-AKI的发病机制主要与缺氧、氧化应激、肾间质纤维化及肾小管细胞凋亡等有关[5]。沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)具有阻断缺氧、抑制氧化应激、肾纤维化及细胞凋亡的作用[5]。白藜芦醇作为SIRT1激动剂,具有广泛的生物学活性[6],在顺铂诱导的AKI、CKD、老年鼠肾小管间质损伤中通过调控SIRT1发挥保护作用[7-9]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在CA-AKI中发挥缺氧适应的作用[10]。然而白藜芦醇是否通过SIRT1与HIF-1α影响CA-AKI尚未见报道。

血氧水平依赖磁共振成像(BOLD)是通过检测血液中氧合血红蛋白和去氧血红蛋白的比例无创反映组织氧含量的影像学手段[11],表观横向弛豫速率(R2*)可反映组织缺氧情况,实验证实R2*值与微电极测量数据的一致性较好[12]。本研究采用BOLD技术探索白藜芦醇在CA-AKI中的作用和机制,旨在为临床寻找预防CA-AKI的药物靶点提供方向。

材料与方法

实验动物及分组雄性实验兔24只,8周龄左右,体重2.5±0.5 kg。所有实验兔自由饮食,适应性饲养1周。按随机数表法分为对照组、白藜芦醇组(Res组)、对比剂相关的AKI组(CA-AKI组)、白藜芦醇治疗组(CA-AKI+Res组),每组6只。Res组和CA-AKI+Res组,给予白藜芦醇按80 mg/(kg·d)口服,连续14 d[5]。CA-AKI组和CA-AKI+Res组,通过耳缘静脉推注碘海醇(350 mg I/mL),剂量为2.5 g I/kg[13]。CA-AKI+Res组在白藜芦醇灌药14 d后注入碘海醇,对照组注射等量生理盐水。所有实验兔在模型建好后第3天行BOLD技术扫描。

仪器与方法实验兔肌肉注射速眠新0.2 mL、3%戊巴比妥钠0.5 mL/kg,待麻醉30 min后,采用GE 3.0T磁共振扫描仪(美国通用电气)及8通道心脏线圈进行BOLD技术扫描,仰卧位,头先进。BOLD图像扫描参数如表1所示。扫描结束后立即过量麻醉处死实验兔,取双肾标本,去除包膜,左肾液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存,用于Western Blot实验,右肾于4%多聚甲醛固定用于病理、Masson及免疫组化实验。

表1 BOLD扫描参数

BOLD图像后处理利用GE adw 4.6后处理工作站软件进行BOLD图像后处理,由两名MRI医师在右肾皮质(CO)和外髓(OM)分别选择感兴趣区(ROI),每个条带选取3个ROI测量R2*值[14],取平均值(图1A)。

生化指标检测各组实验兔建好模型第3天时,经耳缘静脉采血2.5 mL,检测胱抑素C(CysC),经膀胱抽取尿液2.5 mL,检测中性粒细胞相关载脂蛋白酶(NGAL),在4 ℃低温离心机离心(3 600 rpm)10 min,取上清液,采用NGAL、CysC ELISA试剂盒(上海远幕生物科技有限公司)按说明书进行检测。

病理组织学分析常规包埋、切片、脱蜡、水化后行HE染色、Masson染色及免疫组化染色。在400倍光镜下随机选取5个视野,根据肾小管细胞脱落、坏死、胞质空泡、肾小管管腔扩张及碎屑积聚等所占百分比进行评分。评分标准:0,正常;1,≤5%;2,5%～25%;3,25%～75%;4,75%～100%[5]。使用《Image J》软件量化胶原纤维沉积及SIRT1、HIF-1α、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)阳性细胞的百分比。

WesternBlot测定蛋白表达量选用SIRT1抗体(absin,中国);HIF-1α抗体(Novus,美国);B细胞淋巴瘤(Bcl-2)抗体(ProteinTech,中国);Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(ProteinTech,中国);活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)抗体(Abcam,英国);细胞色素C(Cyt-C)抗体(Novus,美国);依次检测。

统计学分析采用《SPSS 22.0》软件对数据进行统计分析。符合正态性检验时,以均数±标准差表示,采用单因素方差分析及Bonferroni进行事后检验。数据不符合正态时,采用Kruskal-Wallis test及Friedman test进行检验。R2*值与病理评分及HIF-1α评分采用Spearman进行相关性分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

血液和尿液指标与对照组相比,CA-AKI组血液CysC和尿液NGAL值明显升高(P均<0.001);与CA-AKI组相比,CA-AKI+Res组中血液CysC(P=0.034)和尿液NGAL值明显下降(P=0.002)(表2)。

表2 各组血液CysC和尿液NGAL检查结果及R2*值的变化

R2*值与对照组相比,CA-AKI组CO和OM带R2*值显著升高(P<0.001;P<0.001);与CA-AKI组相比,CA-AKI+Res组肾脏CO和OM带R2*值显著下降(P=0.015;P=0.002)(表2、图1)。

图1 各组血氧水平依赖磁共振成像技术图像R2*:表观横向弛豫速率;Res组:白藜芦醇组;CA-AKI组:对比剂相关的急性肾损伤组;CA-AKI+Res组:白藜芦醇治疗组;A:伪彩图及感兴趣区勾画;B:R2*值;*：与对照组相比,P<0.05;#：与CA-AKI组相比,P<0.05

肾脏病理损伤与对照组相比,CA-AKI组病理评分显著升高(P<0.001);与CA-AKI组相比,CA-AKI+Res组病理评分明显下降(P<0.001);与对照组相比,CA-AKI组间质胶原纤维沉积量增多(P<0.001);与CA-AKI组相比,CA-AKI+Res组间质胶原纤维沉积量明显下降(P<0.001)。相关性分析显示:肾脏病理评分与R2*值呈显著正相关(r=0.796 0,P<0.000 1)(图2)。

图2 A:CA-AKI组肾脏病理损伤最重，经白藜芦醇治疗后，CA-AKI+Res组肾脏病理损伤明显改善(HE，×400);B:CA-AKI组肾脏胶原纤维沉积量最多，经白藜芦醇治疗后，CA-AKI+Res组肾脏胶原纤维沉积量减少(Masson染色，×400);C:病理评分;D:胶原纤维沉积量分析;E:R2*值与肾脏病理评分相关性分析R2*:表观横向弛豫速率;Res组:白藜芦醇组;CA-AKI组:对比剂相关的急性肾损伤组;CA-AKI+Res组:白藜芦醇治疗组；*：与对照组相比,P<0.05;#：与CA-AKI组相比,P<0.05

肾脏免疫组织化学染色与对照组相比,CA-AKI组中SIRT1蛋白表达下降(P=0.045),HIF-1α蛋白表达明显升高(P<0.001),cleaved caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.001);与CA-AKI组相比,经白藜芦醇治疗后CA-AKI+Res组SIRT1蛋白表达明显升高(P<0.001),HIF-1α蛋白表达下降(P=0.020),cleaved caspase-3蛋白表达下降(P=0.036)(图3A～F);相关性分析显示:HIF-1α表达与R2*值呈显著正相关(r=0.867 5,P<0.000 1)(图3G)。

图3 A:CA-AKI组SIRT1蛋白表达量最少，经白藜芦醇治疗后，CA-AKI+Res组SIRT1蛋白表达量明显增多(SIRT1染色，×400);B：CA-AKI组HIF-1α蛋白表达量最多，经白藜芦醇治疗后，CA-AKI+Res组HIF-1α蛋白表达量下降(HIF-1α染色，×400);C:CA-AKI组cleaved caspase-3蛋白表达量最多，经白藜芦醇治疗后，CA-AKI+Res组cleaved caspase-3蛋白表达量下降(cleaved caspase-3染色，×400);D:SIRT1阳性表达分数;E:HIF-1α阳性表达分数;F:cleaved caspase-3阳性表达分数;G:R2*值与HIF-1α表达相关性分析SIRT1:沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1;HIF-1α:缺氧诱导因子1α;cleaved caspase-3:活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;R2*:表观横向弛豫速率;Res组:白藜芦醇组;CA-AKI组:对比剂相关的急性肾损伤组;CA-AKI+Res组:白藜芦醇治疗组;*：与对照组相比,P<0.05;#：与CA-AKI组相比,P<0.05

肾组织SIRT1/HIF-1α信号通路蛋白与对照组相比,CA-AKI组中SIRT1蛋白表达下降(P=0.012),HIF-1α蛋白表达明显升高(P<0.001);与CA-AKI组相比,经白藜芦醇治疗后CA-AKI+Res组SIRT1(P<0.001)表达上升,HIF-1α蛋白表达下降(P<0.001),HIF-1α下游蛋白Bax(P=0.024)、Cyt-C(P=0.037)、cleaved caspase-3(P=0.020)蛋白也显著下降,而Bcl-2蛋白升高(P=0.014)(图4)。

图4 各组SIRT1/HIF-1α信号通路各蛋白表达SIRT1:沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1;HIF-1α:缺氧诱导因子-1α;Bcl-2:B细胞淋巴瘤2;Bax:Bcl-2相关X蛋白;cleaved caspase-3:活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3;Cyt-C:细胞色素C;β-actin:β肌动蛋白;Res组:白藜芦醇组;CA-AKI组:对比剂相关的急性肾损伤组;CA-AKI+Res组:白藜芦醇治疗组;A:SIRT1、HIF-1α及下游靶蛋白表达;B:SIRT1、HIF-1α及下游靶蛋白表达评分;*：与对照组相比,P<0.05;#：与CA-AKI组相比,P<0.05

讨 论

本实验发现白藜芦醇通过上调SIRT1蛋白,改善CA-AKI的肾功能,减轻肾小管坏死,缓解肾脏缺氧,抑制了肾纤维化及肾小管细胞的凋亡,而BOLD技术可用于评价白藜芦醇的保护作用。

白藜芦醇对CA-AKI的保护作用可能与以下机制有关:(1)白藜芦醇通过调控SIRT1的表达,缓解对比剂自身的毒性作用,减少肾小管上皮细胞的损伤和凋亡[6]。因为在CA-AKI+Res模型中,白藜芦醇通过调控SIRT1,降低了凋亡相关蛋白Bax,cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白的表达,同时增加了Bcl-2蛋白的表达,进而发挥了抑制凋亡的作用;(2)白藜芦醇通过SIRT1改善了CA-AKI导致的肾功能受损。因为白藜芦醇作用于CA-AKI后 CysC和NGAL明显降低,证实了白藜芦醇可促使肾脏提高肌酐清除率,降低肾小管细胞的损伤;(3)白藜芦醇通过调控SIRT1缓解了肾脏纤维化程度,Masson染色可以证实这一点。在临床中,对CA-AKI患者而言,抑制其肾纤维化可以防止CA-AKI向持续性肾功能不全进展。据报道,与传统观点认为CA-AKI是一过性肾损伤所不同,如今更多证据证明患者一旦发生CA-AKI后,肾脏功能并不能完全恢复,其进展为持续性肾功能不全风险达40%,发展为终末期肾衰竭风险高达8%[3]。因此,利用白藜芦醇抑制CA-AKI患者肾纤维化进展,将有助于防止其向肾功能不全发展,进而阻止CKD的发生。CA-AKI发生肾纤维化的过程有几个关键阶段,包括细胞外基质的过度积聚、肾间质成纤维细胞的激活、上皮细胞-间充质转化和炎性细胞浸润及线粒体功能受损[15]。研究表明白藜芦醇上调SIRT1后可能作用于其下游的靶蛋白[如转化生长因子β1(TGF-β1)、叉头状转录因子O1(FoxO1)、过氧化物酶体增殖激活受体共激活因子1α(PGC-1α)及核因子κB(NF-κB)等]发挥作用有关[16-17],相关研究有待于今后实验进一步证实。

我们先前在CA-AKI研究中发现肾脏缺氧会引起HIF-1α表达升高[18],而且已有证据表明缺氧在CA-AKI中扮演重要角色[19]。CA-AKI患者在注入CM后会导致血管内皮细胞受损发生缺氧,而缺氧会破坏细胞线粒体有氧代谢,进而导致活性氧大量聚集,造成氧化应激反应加重,导致肾小管上皮细胞损伤,转运功能发生异常,进一步加剧CA-AKI缺氧,HIF-1α表达升高[20]。此外,对比剂自身毒性作用促使肾血管内皮细胞发生凋亡,炎症反应加剧,导致肾组织低灌注和缺氧,反过来将加剧CM本身造成的肾脏损伤,促进HIF-1α表达升高[21]。本研究证实:白藜芦醇通过上调SIRT1调控HIF-1α蛋白本身及其下游的靶蛋白,并通过复杂的信号通路在CA-AKI中发挥保护作用。随着SIRT1蛋白表达上升,HIF-1α蛋白表达下降,肾脏缺氧逐渐改善,BOLD技术也进一步发现经白藜芦醇治疗后CA-AKI+Res组实验兔肾脏各带R2*值较CA-AKI组明显减低(CO带:P=0.015;OM带:P=0.002),说明白藜芦醇可以有效抑制CA-AKI的急性缺氧。同时数据也显示R2*值与HIF-1α表达具有显著相关性,证实了BOLD技术在评估白藜芦醇对CA-AKI的保护作用中的价值。

本研究尚存在以下不足:(1)实验兔数量较少,未来实验应进一步增加实验兔数量,同时需增加SIRT1抑制剂组来证实结果的可靠性;(2)本研究利用BOLD技术评估白藜芦醇的保护作用,但BOLD技术存在受血容量体积分数及氧解离曲线影响[22],有待进一步改进;(3)BOLD图像后处理时采用手动勾画ROI,尽管本研究已测量三次取平均值,但仍存在一定误差;(4)今后研究应从细胞水平进一步验证白藜芦醇在CA-AKI中的作用。

小结:本研究结果证实白藜芦醇在CA-AKI中发挥保护作用,其通过促进SIRT1蛋白表达,抑制HIF-1α蛋白升高发挥抗缺氧、抗细胞凋亡、防止肾纤维化和抑制肾功能受损的作用。BOLD技术可用于评估白藜芦醇对CA-AKI的保护作用。总之,了解白藜芦醇和CA-AKI的关系将有助于临床给予有效的干预,对患者在使用CM时避免发生CA-AKI提供理论依据。