荣 华，杨石坤，杜有家，豆腾飞，黄 英，武祥伟，史庆超，王晓雯

(1 云南农业大学 a 动物科学技术学院，b 云南省高校高原渔业资源保护与可持续利用重点试验室，云南 昆明 650201；2 内江师范学院 长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点试验室，四川 内江641112)

鱼胶(鱼鳔的干制品)富含胶原蛋白，营养价值极高，与燕窝、鱼翅齐名，系“海洋八珍”之一，有“海洋人参”之美誉[1]。近年来，随着人们对鱼胶营养和保健价值的认识，市场上对高品质鱼胶的需求日益旺盛，据不完全统计，2019 年全国鱼胶产量7 423 t，产值近200 亿元。浅色黄姑鱼(Nibeacoibor)俗称白奈，是我国东南沿海地区用于生产名贵鱼胶——白花胶的重要海水养殖品种[2]，开展浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白代谢相关研究，对提高鱼胶产量和品质具有重要意义。有学者发现，在饲料中添加蚕豆[3]、杜仲[4]、脯氨酸[5-7]和羟脯氨酸(Hyp)[8]可以促进鱼类胶原蛋白沉积。笔者前期研究也发现，Hyp可以促进浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的沉积[9-10]，但对其分子机理缺乏深入探讨。

转化生长因子β(TGF-β)是一种调节细胞生长、分化和增殖的多功能细胞因子，对间充质细胞的主要作用是刺激细胞外基质的沉积。此外，TGF-β还可诱导肌成纤维细胞分化，上调Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅹ型胶原蛋白基因的表达，促进细胞外基质胶原蛋白沉积[11]。转化生长因子细胞信号通路(TGF-β/Smads)作为调控胶原蛋白代谢的经典途径，主要参与细胞外基质胶原蛋白的沉积[11-13]。然而，TGF-β/Smads信号通路在鱼类胶原蛋白代谢中的作用鲜有研究报道。有研究表明，积雪草皂苷[14]、β-拉帕醌[15]和氧化苦参碱[16-18]等干扰剂可以作用于TGF-β/Smads通路中特定配体，导致整个信号通路效应发生变化，致使机体合成胶原蛋白的能力发生变化。Wu等[19]发现，氧化苦参碱可通过抑制TGF-β1、细胞信号转导分子3(Smad3)等的表达，对CC4诱导的大鼠肝纤维化具有明显的拮抗作用。4-(1-(2-(2-苄基吡咯烷-1-基)-5-氯烟酰胺)环丙基)苯甲酸甲酯(SIS3)是一种新型的TGF-β/Smads信号通路抑制剂，主要特异抑制Smad3，在医学上应用广泛[20]。Matsubara等[21]发现，SIS3处理的肝细胞对TGF-β、肿瘤坏死因子(TNF-α)的响应降低，从而减弱肝细胞的纤维化。SIS3可以抑制心肌成纤维细胞的分化和胶原蛋白的生成[22-23]。笔者前期研究发现，TGF-β/Smads是参与脯氨酸促进黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积调控的重要途径[7]，但其是否也参与调控Hyp促进黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积尚未可知。为此，本试验用Hyp促进浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积，然后利用氧化苦参碱和SIS3对TGF-β/Smads通路进行抑制，比较抑制与否对浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白含量的影响，探讨TGF-β/Smads通路在Hyp促胶原蛋白沉积过程中的作用，为胶原蛋白代谢的营养调控提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

SIS3，分子式为C28H28ClN3O3，购于MedChemExpress(MCE)公司(中国，上海)。氧化苦参碱，分子式为C15H24N2O2，购于MedChemExpress(MCE)公司。Hyp含量测定试剂盒(Art.No.A030-2；南京建成生物工程研究所)。TransScript®One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit(Trans Gen生物技术，北京)。SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒(Takara，大连)。丁香酚溶液(阿拉丁试剂有限公司，中国)。主要仪器有Infinite®Pro 200酶标仪(Tecan、瑞士)、Nanodrop®ND-2000分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop,USA)、Roche Light Cycler®480 System实时荧光定量PCR(RT-qPCR)仪(Roche，瑞士)。

1.2 饲料配制

根据文献[9]配制Hyp空白组和Hyp添加组饲料(表1)。

表1 试验饲料配方及养分含量(风干基础)Table 1 Formulation and nutrient contents of the experimental diets(air-dry basis) g/kg

Hyp空白组不额外添加Hyp，Hyp添加组添加9.70 g/kgL-羟脯氨酸，用丙氨酸来平衡饲料中的氮，参考美国国家科学研究委员会(NRC，2011)中大黄鱼的营养需求设计其他营养成分的含量[24]。饲料中氨基酸组成见表2。饲料原料过0.42 mm筛，经充分混合，用2.5 mm直径的膨化机制粒，在自然通风环境中风干。干颗粒饲料被密封在塑料袋里于-20 ℃存储备用。

表2 试验饲料的氨基酸组成(以干物质计) Table 2 Amino acid composition of experimental diets μmol/g

1.3 试验设计

养殖试验在广东省汕头市南澳县汕头大学海洋生物临海试验站进行。浅色黄姑鱼购自当地某苗种孵化场。幼鱼购回后，在一个大的浮动网箱(长×宽×深=3 m×3 m×2 m，)暂养2周，期间投喂揭阳通威股份有限公司生产的商业饲料(粗蛋白40.0%，粗脂肪10.0%)。试验前，试验鱼先禁食24 h，用40 mg/L丁香酚溶液麻醉后称体质量并分组。300尾试验鱼(体质量(11.621±0.154) g/尾)被随机分为4组(Hyp空白组、Hyp添加组、SIS3干扰组、氧化苦参碱干扰组)，每组3个重复，每重复25尾鱼(在长×宽×深 = 1 m×1 m×1.5 m的网箱中养殖)。

在为期8周的养殖试验中，Hyp空白组试验鱼饲喂不添加Hyp的日粮，其他3组试验鱼均饲喂添加Hyp的日粮，SIS3、氧化苦参碱干扰组试验鱼在4周后腹腔注射SIS3和氧化苦参碱注射液进行干扰试验，每周注射1次，直至试验结束。为了消除注射应激及SIS3、氧化苦参碱注射液中溶剂dimethysulfoxide(DMSO)对鱼体基础代谢的影响，减少试验系统误差，Hyp空白组和Hyp添加组试验鱼注射等量的DMSO注射液。试验期间，每天人工饱食投饵2次(07:00和16:30)，记录好饲料投喂量。观察记录鱼的健康状况及环境变化等，在试验过程中，温度23～30 ℃，pH值7.8～8.1，氨氮质量浓度低于0.05 mg/L，盐度31～33 g/L，溶解氧5.2～6.0 mg/L。

因溶剂内含有DMSO，一定浓度的DMSO对鱼体有毒副作用，所以参考SIS3[20]和氧化苦参碱的给药量[19,25-27]并结合预试验结果(试验鱼腹腔注射液体100 μL/尾无死亡)，确定SIS3和氧化苦参碱的稀释质量浓度及注射方案如下：(1)SIS3注射液。将SIS3用DMSO配成20 mg/mL的储存液，-20 ℃储存1个月，使用前利用生理盐水稀释成1 mg/mL注射液进行腹腔注射。按照100 μL/尾给药，当时鱼体质量约50 g，给药量为2 mg/kg。(2)氧化苦参碱注射液。在超声辅助下，将氧化苦参碱用DMSO配制成100 mg/mL储存液，并按照上述方案稀释成5 mg/mL注射液。按照100 μL/尾给药，当时鱼体质量约50 g，给药量10 mg/kg。(3)DMSO注射液。将DMSO溶液用生理盐水按1∶20体积比稀释成注射液，参照SIS3和氧化苦参碱的给药量确定注射量(100 μL/尾)。

1.4 样品采集

养殖试验结束后，停食24 h，采用100 mg/L丁香酚麻醉，称体质量，计算鱼的生长和饲料利用率。每个重复随机选取6尾试验鱼，测量个体体质量、体长，计算肥满度等；取鱼鳔用于胶原蛋白含量的测定。每个重复随机选取6尾试验鱼，采集其肝脏(右侧)，分成小块(1 cm×1 cm)固定于Bouin’s液中，用于组织切片观察。

此外，每个重复随机选取4尾试验鱼，采集鱼鳔组织样本，快速收集好后立即浸入液氮，随后储存在-80 ℃，用于总RNA的提取。

1.5 生长性能测定

根据饲养试验中测定的鱼体质量、体长、饲料消耗等指标，计算特定生长率(SGR)、饲料系数(FC)、鳔体比(SBSI) 、存活率(SR)、肥满度(CF) ：

SGR(%/d)=[(ln FBW-ln IBW)/t]×100，

FC=FI/(FBW-IBW)，

SBSI=SBW/BW×100%，

SR=FFN/IFN×100%，

CF(g/cm3)=BW/BL3。

式中：FBW和IBW分别代表试验鱼的终末体质量和初始体质量(g)，t为试验时间(d)，FI代表采食量(g)，SBW代表鱼鳔重(g)，BW代表鱼体质量(g)，FFN代表终末鱼数，IFN代表初始鱼数，BL代表体长(cm)。

1.6 鱼鳔胶原蛋白含量测定

用Hyp含量测定试剂盒测定鱼鳔中的胶原蛋白含量，具体操作方法参考试剂盒说明书进行，使用Infinite®Pro 200酶标仪在550 nm波长下测定试验样品和标准品(试剂盒自带)的吸光度(OD550)，利用标准品的OD550与给定浓度绘制标准曲线，试算试验样品中Hyp含量。胶原蛋白的含量由Hyp的含量乘以8估算得到[10]。

1.7 肝脏组织形态学检测

肝脏组织形态学检测在武汉赛维尔生物科技有限公司协助下完成，试验步骤简介如下：1)将新鲜的组织样品固定于体积分数4%多聚甲醛24 h以上；2)用体积分数75%酒精-无水乙醇按梯度脱水6 h；3)使用二甲苯取代酒精透明2次，每次10 min；4)在温箱中，将已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，浸蜡3次，每次1 h；5)将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋后，使用轮转式石蜡切片机对包埋好的组织进行切片，切片厚度控制在5～6 μm；6)将切片烤干，HE染色后，脱水封片，最后进行显微镜镜检，采集图像分析。

1.8 胶原蛋白代谢相关基因及TGF-β/Smads通路关键基因的表达分析

鱼鳔组织总RNA根据Trizol (InvitrogenTM)试剂说明书，使用氯仿-异丙醇法提取，通过1.2%琼脂糖凝胶分析确定其完整性和质量，利用Nanodrop®ND-2000分光光度计于260和280 nm处测定吸光度(OD260、OD280)，计算OD260/OD280，确定RNA的最终浓度。使用TransScript®One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20 ℃储存备用。

对胶原蛋白代谢相关基因Ⅰ型胶原蛋白α1(COL1A1)、COL1A2、Ⅰ型脯氨酸羟化酶(P4Hα(Ⅰ))、P4Hα(Ⅱ)、P4Hα(Ⅲ)及TGF-β/Smads通路关键基因TGF-β、转化生长因子受体(TGF-βRT)Smad2、Smad3、Smad4和Smad7进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)表达分析，以β-actin为管家基因。根据大黄鱼(Larimichthyscrocea)、鲈鱼(Micropterussalmoides)和鳜鱼(Sinipercachuatsi)等的胶原蛋白代谢相关基因的核心序列保守区，利用Primer Premier 5.0软件(USA)设计其特异性引物(表3)，交由华大基因(深圳)合成。

表3 胶原蛋白代谢相关基因的RT-PCR引物序列Table 3 Sequences of real-time PCR primers for genes of collagen metabolism

表3(续) ContinuedTable 3

使用SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒配制RT-qPCR反应体系(20 μL)，在Roche Light Cycler®480 System RT-qPCR仪上进行反应。使用2-ΔΔCt法[28]计算基因相对表达量。使用倍数变化(fold change)法将基因相对表达量换算成倍数变化进行绘图。

1.9 数据统计与分析

所有数据均采用SPSS 20.0程序(SPSS,Inc.，Chicago， IL，USA)进行单因素方差分析(ANOVA)，并采用Tukey进行组间显著性检验。数据以“平均值±标准误”(n=3)呈现，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Hyp及干扰剂对浅色黄姑鱼生长的影响

由表4可知， Hyp添加组试验鱼的特定生长率(SGR)显著高于Hyp空白组(P<0.05)，其余组间差异不显著；其他指标在4个组间均无显著差异(P>0.05)。结果表明，饲料中添加Hyp能显著促进浅色黄姑鱼的生长；注射干扰剂SIS3和氧化苦参碱对试验鱼生长无显著影响(P>0.05)。

2.2 Hyp及干扰剂对浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积的影响

Hyp和TGF-β/Smads通路抑制剂对浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白含量的影响见图1。

图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05) Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)图1 Hyp和TGF-β/Smads通路抑制剂对浅色黄姑鱼 鱼鳔胶原蛋白含量的影响Fig.1 Effect of Hyp and TGF-β/Smads pathway inhibitors on collagen content in swim bladder of Nibea coibor

由图1可知， Hyp添加组试验鱼鱼鳔胶原蛋白含量显著高于Hyp空白组(P<0.05)，表明饲料中添加Hyp对鱼鳔胶原蛋白沉积具有显著的促进作用；SIS3干扰组鱼鳔胶原蛋白含量显著低于Hyp添加组(P<0.05)；氧化苦参碱干扰组胶原蛋白含量低于Hyp添加组，但二者差异不显著(P>0.05)。结果表明，抑制TGF-β/Smads通路可降低浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白的沉积；与SIS3相比，氧化苦参碱的抑制效果稍差。

2.3 DMSO对浅色黄姑鱼肝脏组织结构的影响

试验结果(图2)显示，各试验组肝脏组织结构完整，细胞排列紧密，胞质界限分明且细胞数量较多，无病理性现象，表明在本试验条件下DMSO对浅色黄姑鱼健康无不良影响。

2.4 Hyp及干扰剂对浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白代谢相关基因表达的影响

Hyp及干扰剂对浅色黄姑鱼鱼鳔中胶原蛋白代谢相关基因表达水平的影响见图3。

A～D分别为Hyp空白组、addition Hyp添加组、SIS3干扰组和氧化苦参碱干扰组 A-D indicate Hyp blank group,Hyp addition group,SIS3 interference group and oxymatrine interference group,respectively图2 DMSO对浅色黄姑鱼肝脏组织结构的影响Fig.2 Effect of DMSO on liver tissue structure of Nibea coibor

以Hyp空白组(对照组)为基线(横轴)，Y轴上的数据大于0表示与对照组相比表达上调，具体数据代表上调的倍数； 数据小于0表示表达与对照组相比下调，具体数据的绝对值代表下调的倍数。图柱上标注*表示与Hyp空白组差异显著(P<0.05) Taking the Hyp blank group (control group) as the baseline (horizontal axis),a value greater than 0 on the Y-axis indicates that the expression is up-regulated and the specific value represents the fold of the up-regulation.On the contrary,less than 0 means down-regulation,and the absolute value represents the fold of down-regulation.* indicates significant differences compared with the Hyp blank group (P<0.05)图3 Hyp及干扰剂对浅色黄姑鱼鱼鳔中胶原蛋白代谢相关基因表达水平的影响Fig.3 Effects of Hyp and inhibitors on expression levels of collagen-metabolism-related genes in swim bladder of Nibea coibor

由图3可知，Hyp添加组鱼COL1A1和COL1A2相对表达量均显著高于Hyp空白组(P<0.05)，说明饲料中添加Hyp可上调COL1A1和COL1A2基因的表达；SIS3和氧化苦参碱干扰组COL1A1和COL1A2基因表达量显著低于Hyp添加组(P<0.05)，说明抑制TGF-β/Smads通路可显著下调浅色黄姑鱼鱼鳔中COL1A1和COL1A2基因的表达。Hyp添加组、SIS3干扰组和氧化苦参碱干扰组中P4Ha(Ⅲ)基因表达量均显著低于Hyp空白组(P<0.05)，说明饲料中添加Hyp可显著下调P4Hα(Ⅲ)基因的表达，而抑制TGF-β/Smads通路对其作用不明显。浅色黄姑鱼鱼鳔中P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)、TGF-β、TGF-βRT、Smad3、Smad4和Smad7基因的表达相对稳定，均不受Hyp的影响。

3 讨 论

氨基酸在促进动物生长、维持机体正常生理及营养代谢中起着至关重要的作用[29]。饲料中Hyp含量较少，特别是植物源饲料中几乎不存在Hyp[30]。越来越多的证据表明[31-34]，提供充足的Hyp有利于鱼类的健康生长。本研究也发现，Hyp显著提高了浅色黄姑鱼的特定生长率，作者前期研究也发现，添加Hyp对浅色黄姑鱼[9]和双棘黄姑鱼[31]的生长具有显著促进作用。Wei等[32]曾报道，饲料中添加Hyp可以促进大黄鱼的生长性能，在Hyp添加水平为0.33%时，大黄鱼可获得最佳的特定生长率。Liu等[33]研究表明,以植物蛋白为基础的饲料中添加Hyp可以显著促进大菱鲆的生长。在高比例植物源饲料中添加0.28%的Hyp可以增加三文鱼的体质量[34]。然而Albrektsen等[35]研究发现，三文鱼的生长性能不受Hyp水平的显著影响；Zhang等[8]在大菱鲆中也未发现Hyp对生长具有促进作用。上述研究中，鱼的种类、大小、试验饲料和水产养殖条件存在较大差异，这可能是致试验结果差异的主要原因。如在Liu等[33]与Zhang等[8]的研究中鱼种虽均为大菱鲆幼鱼，但饲料配方中植物蛋白的比例却相差甚远；饲料中添加Hyp对246～264 g三文鱼[34]和2.4 kg三文鱼[35]的试验结果截然相反，这有可能是因为仔鱼期的特定生长率要远大于育成期，所以生长对营养素的响应度在仔鱼期较成鱼期会更敏感。分析肝脏组织形态是了解机体健康情况的一个重要手段。本研究干扰剂注射液中含一定浓度的DMSO，过量的DMSO对动物有一定毒副作用，因此有必要就DMSO对试验结果的影响程度加以评估，结果发现，本试验条件下干扰剂DMSO对浅色黄姑鱼的毒副作用较小，不足以影响营养代谢实验结果。

Hyp作为胶原蛋白的重要组成部分，能够在一定程度上促进胶原蛋白的沉积，而关于Hyp促进胶原蛋白沉积的作用机制鲜有报道[36]。TGF-β/Smads信号通路在调控胶原蛋白代谢过程中具有重要作用，有研究表明，脯氨酸[7]和蚕豆[37]可通过TGF-β/Smads信号通路促进鱼类胶原蛋白沉积，而有关TGF-β/Smads信号通路是否也参与调控Hyp对浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积的促进作用目前尚未见报道。本研究通过抑制剂干扰TGF-β/Smads通路，比较抑制与否，Hyp对浅色黄姑鱼胶原蛋白沉积及相关基因表达的影响，结果发现，添加Hyp显著促进了浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积，一些学者在大菱鲆上也发现了类似结果[8,33]，说明饲料中添加适量的Hyp能够促进胶原蛋白的合成。为了探讨Hyp促进胶原蛋白沉积的作用机制，本研究分析了胶原蛋白代谢相关基因及TGF-β/Smads信号通路中关键基因的表达情况，结果发现，Hyp显著上调COL1A1和COL1A2的表达，这也与之前在双棘黄姑鱼中的研究结果相吻合[7]，说明可能通过上调胶原蛋白基因的转录来促进胶原蛋白合成。本研究中，SIS3和氧化苦参碱干扰对Hyp介导的浅色黄姑鱼鱼鳔中COL1A1和COL1A2基因表达有明显的下调作用，这可能是抑制剂导致胶原蛋白沉积下降的原因。这也与早期研究报道的氧化苦参碱和SIS3能够降低机体组织的纤维化(胶原蛋白的沉积过程)[16-19]相一致。TGF-β/Smads信号通路中包含多个信号传导因子，如TGF-β和TGF-βRT可刺激Smad2、Smad3与Smad4缔合形成易位复合物进入细胞核，通过其他转录因子与靶基因(如COL1A2)启动子区结合，调控基因表达[38-39]。近年来，人们逐步证实在组织纤维化的过程中，经典的TGF-β/Smads通路并不是唯一的信号传递途径，且TGF-β的胞内信号传递在不同细胞中有不同的信号通路，TGF-β下游的信号传导分子除了经典的Smad2、Smad3之外，还存在其他一些非Smads通路，如MAPK通路、AKT/PIK3通路等[12]。本试验中，SIS3和氧化苦参碱干扰对TGF-β/Smads信号通路中关键基因表达并无显著影响，说明Hyp促进鱼鳔中胶原蛋白沉积可能与TGF-β/Smads信号通路无关。本研究还发现，P4Hα(Ⅲ)基因的表达水平在Hyp添加组显著下调，但并不受抑制剂的影响。Hyp不能作为合成胶原蛋白的底物，自然状态下也不存在游离的Hyp，Hyp是在胶原蛋白肽链形成后，由脯氨酰残基羟基化形成的[40]。脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，P4H)是催化脯氨酰残基羟基化的主要酶，主要有3个α亚基，由脯氨酸羟化酶基因(P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)和P4Hα(Ⅲ))编码[41]。添加Hyp可能导致P4H活性降低，减弱了Pro羟基化形成Hyp这一过程，直接抑制了胶原蛋白的降解，从而间接地促进了胶原蛋白的沉积。正常生理状态下，胶原蛋白的合成和分解过程时刻都处在动态的平衡中，本试验中添加Hyp导致鱼鳔中胶原蛋白沉积增加，可能是胶原蛋白合成增加与降解减少共同的作用结果，而TGF-β/Smad信号通路在其中发挥的作用有限。

综上所述，Hyp对浅色黄姑鱼的生长和鱼鳔胶原蛋白沉积有一定的促进作用，而SIS3干扰抑制后，鱼鳔胶原蛋白含量显著降低，对TGF-β/Smads通路中相关基因表达的影响，仅影响了Smad2的转录；氧化苦参碱干扰对TGF-β/Smads通路中相关基因的影响不显著，且干扰前后鱼鳔中胶原沉积无显著性差异。结果表明，SIS3对胶原蛋白代谢的抑制作用要强于氧化苦参碱，且TGF-β/Smads通路不是调控Hyp促进胶原蛋白沉积的主要路径。Hyp促进胶原蛋白沉积的作用机理可能与抑制胶原蛋白的降解有关。

志谢：感谢汕头大学理学院海洋生物研究所为本试验提供试验场所，感谢温小波教授和林帆博士对文稿所提的宝贵意见。