薛运波│文 李志勇│图

1.蜜蜂转基因技术

蜜蜂转基因育种（transgenic breeding）是通过基因工程技术将外源目的基因导入受体细胞，整合到受体细胞基因组中，并使外源基因得到表达和遗传，以此获得新品种。该技术的根本意义在于它克服固有的生殖隔离，实现物种间遗传物质的交换，在改良蜜蜂抗病和经济性状以及生物反应器利用等方面展示了良好的应用前景。

自从1982年成功研究出首例转基因果蝇以来，转基因昆虫的研究便引起科学家们极大的兴趣。目前，已经获得成功的转基因昆虫有黑腹果蝇、海地果蝇、地中海实蝇、家蚕、蚊子等。鉴于蜜蜂特殊的社会行为和级型分化现象，有学者认为以下两种方法是蜜蜂转基因较好的途径：一是以蜜蜂人工授精技术为基础的精子介导转基因法，二是蜜蜂卵或幼虫的转基因操作与蜜蜂人工孵育技术相结合的方法。

（1）精子介导转基因法

1971年，Brackett 等发现精子细胞具有自发地吸收外源DNA，并可在受精的过程中将外源DNA 携带进卵内。用精子作为转移外源DNA 的载体，将DNA 溶液和动物精子共浴，精子能主动吸附外源DNA，利用这一点可以很容易地将外源DNA 导入精子细胞或结合于精子细胞表面。再通过人工授精，将外源DNA 带入受精卵进而发育成个体（图1），从而生产转基因动物。利用精子介导的转基因蜜蜂的研究也有成功报道。1991年，Atkinson 等首次将蜜蜂精子与外源DNA 进行共培养，证实蜜蜂精子也能够吸收其他动物的DNA。2000年，Robinson 等研究精子介导转染法用于蜜蜂转基因的可行性。结果表明，蜜蜂精子能将外源线性质粒DNA 携带进入卵子，外源DNA能在受体蜜蜂个体中存在数月之久，能在幼虫期进行表达，至少能稳定遗传三代。尽管没有找到外源DNA 整合到蜜蜂基因组上的证据，但该研究证明蜜蜂精子同样具有携带外源DNA 进入卵子的能力。基于蜜蜂人工授精技术的精子介导转基因，操作简便，成功率高，成本低廉，便于大批量筛选，不但可以用于蜜蜂的分子育种，培育出具有抗杀虫剂特性、抗病虫害以及耐寒等蜜蜂品种，而且可以用于蜜蜂基因功能分析及用作生物反应器等研究。

图1 介导后的卵在实验室培养出蜜蜂

（2）显微注射法

借助光学显微镜，直接把外源性DNA 注射到蜜蜂卵或者幼虫体内，获得转基因蜜蜂。与其他昆虫相比，蜜蜂卵的个体和卵黄区均较大，卵壳韧性不易破碎，卵孔明显，很适合于进行显微注射操作（图2）。由于蜂卵产下后1 ～2 小时内卵孔是开启的，显微注射操作可以在此时进行，通过卵孔将外源DNA 注入卵内。人为操作势必会在卵体上留下异味，遭到蜂群的清理，以此，蜜蜂幼虫的室内人工哺育技术可以作为蜂卵显微注射后的辅助技术。Milne 等对意蜂卵显微注射技术做了初步研究，他们在室温下将1日龄卵固定在玻璃片上，在卵上覆盖一层低粘度石蜡油，使用显微操作器向卵注射石蜡后，将其放入35℃保温箱内孵化，观察卵的发育。注射石蜡油的卵的孵化率降至21%，孵化时间延长。外源DNA 能否通过显微注射技术整合到蜜蜂基因组上并有效的表达和遗传尚不得而知，显微注射法用于蜜蜂转基因研究还有很长的路要走。

图2 转基因显微注射设备

2.基因克隆

克隆技术是指从众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择，获得目的基因或筛选细胞的技术操作。基因克隆（gene cloning）是上世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，是基因工程的上游工程。美国斯坦福大学的Berg 等人于1972年把一种病毒的DNA 与λ 噬菌体DNA 用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA 连接酶把这两种DNA 分子连接起来，于是产生一种新的重组DNA 分子，从而产生了基因克隆技术。1973年，Cohen 等人把一段外源DNA 片段与质粒DNA 连接起来，构成一个重组质粒，并将该重组质粒转至大肠杆菌，第一次完整地建立起基因克隆体系。采用重组DNA 技术，将不同来源的DNA 分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子，将这个杂合分子转移至一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程即是基因克隆。基因克隆过程会涉及到一系列的分子生物学技术（图3），包括目的DNA 片段的获得、载体的选择、工具酶的选用、体外重组、宿主细胞导入和重组子筛选技术等等。基因克隆技术的出现为蜜蜂转基因育种奠定基础。

图3 基因克隆技术检测设备