余敏芬，梅家琪，何立平，李东宾，徐栋斌，杨影，袁虎威，闫道良，郑炳松

（1.浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300；2.浙江农林大学 浙江省森林芳香植物康养功能研究重点实验室，浙江 杭州 311300；3.宁波市林场，浙江 宁波 315440）

栎属Quercus是壳斗科Fagaceae 中分布最广、种类最多的属，主要分布在亚洲、非洲、欧洲以及美洲地区[1]。如我国的栓皮栎Q.variabilis，从辽宁省南部到云南省中部皆有分布，并且分布的海拔上限从北到南不断增加[2]，横跨亚热带、热带[3]。与其它树种相比，栎属植物应用颇多。栎属植物的木材坚硬。赵泾峰等[4]发现陕西4 种栎属植物的木材皆可用作实木地板和建筑材料。栎属Quercus树种又称橡树，其种子被称作橡子。橡子可以食用，营养丰富。魏练平等[5]测定了安徽黄山出产的橡子粉，其淀粉含量高达83.24%。橡子亦可用于酿酒。据报道，将橡子粉和糯米以一定的比例混合发酵，可以产生大量酒精，成品酒中富含糖分、有机酸，还含有氨基酸、矿质元素和维生素等[6]。由此可见，栎属植物具有巨大的开发利用价值。

鉴定不同栎属植物的遗传多样性和亲缘关系是对其进行有效利用的基础和前提。分子标记是分析物种遗传多样性和亲缘关系的有力工具。在众多分子标记中，简单序列重复间扩增（inter-simple sequence repeat，ISSR）标记是目前最有效的分子标记之一[7]，具有操作简单、多态性高、经济方便等优点。ISSR 标记是以在简单重复序列的末端加2～4 个随机核苷酸序列为引物，通过PCR 反应在简单重复序列间进行扩增的标记技术[8]。ISSR分子标记可用于分子辅助育种、亲缘关系分析和遗传多样性分析等多个方面。目前，已有大量研究利用ISSR 分子标记对植物进行亲缘关系分析和遗传多样性分析。廖菊阳等[9]利用ISSR 标记对28 种杜鹃属Rhododendron植物进行了分析，扩增出127 个多态性位点，多态性比例高达96.21%，并以平均相似系数0.588 为阈值，将28种杜鹃属植物分为三个类群。曾惠敏等[10]利用ISSR 标记对14 个八仙花（绣球Hydrangea macrophylla）品种进行分析，计算出的14 个八仙花品种的遗传相似系数皆大于0.9，表明了其相近的亲缘关系，并在遗传相似性系数约0.38 处将14 个八仙花品种分为两类。李杉杉[11]等利用ISSR 标记对20 个种质的紫花苜蓿Medicago sativa进行遗传多样性分析，其多态性条带比率达82.67%。禹靓倩等[12]采用ISSR 分子标记分析了27 个栎属树种的亲缘关系，利用12 条引物扩增出140 个位点，其中多态性位点比率为82.14%，将27 个栎属树种分为5 类。Coutinho等[13]利用ISSR 分子标记分析了国外部分栎属资源的遗传多样性和亲缘关系，为其开发利用奠定了基础。

近年来，我国从国外引进了一些栎属植物，但对这些栎属植物的遗传多样性和相对亲缘关系还不清楚，限制了其在我国的开发利用。本文拟用ISSR 分子标记技术对9 种从国外引进的栎属植物（种或品种）进行遗传多样性分析和亲缘关系分析，以期为从国外引种的栎属植物的有效利用提供科学依据并奠定坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2017 年10 月，宁波市林场从海宁俄勒岗苗木繁育技术有限公司引进‘针栎’Q.palustris‘Pin Oak’、‘猩红橡木’Q.coocinea‘Scarlet Oak’、‘太平洋光辉’Q.palustris‘Pacific Brilliance’、‘沼泽白橡木’Q.icolor‘Swamp White Oak’、‘北方红橡’Q.rubra‘Red Oak’、‘绿柱’Q.palustris‘Green pillar’ 6 个栎属品种（均为海宁俄勒岗苗木繁育技术有限公司2014 年从美国引入）地径为2～5 cm 的实生苗，按4 m×4 m 株行距在露地无保护状态下栽培。种植试验地的海拔为730 m，面积为0.67 hm2。2017 年11 月，宁波市林场从湖南长沙引进柳叶栎Q.phellos和2 种娜塔栎Q.nuttallii种质（红叶娜塔栎和绿叶娜塔栎）苗木，均为早期从北美引进种子进行播种培育的5 年生实生苗。这些栎属品种引进后均生长良好，能在宁波市林场基地正常萌芽、生长、变色和落叶，但部分栎属品种冬天易受雪压折断，部分出现病虫害，还在进一步观察和研究中。

本文以这9 种国外引进的栎属植物的叶片为实验材料，叶片于2018 年5 月9 日采自宁波市林场种植基地，多株混合采样，样品采集后立即放入液氮中暂存，随后带到浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室，在－80℃超低温冰箱中保存以用于后续测定。9 种栎属植物的基本信息如表1。

表1 9 种国外引进栎属植物的基本信息Table 1 Morphological traits of introduced nine species/cultivars of Quercus

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 的提取及质量检测 参考王玲玲等[14]的方法，利用改良CTAB 法提取栎属植物叶片基因组DNA。每个样品至少进行3 次重复提取。提取后用NanoDrop-1000 分光光度计检测DNA 的浓度和纯度（OD260/280）；用质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的质量。

1.2.2 ISSR引物的筛选及PCR扩增 基于前人的研究[15-17]，结合加拿大哥伦比亚大学报道的100条栎属植物ISSR引物，从中筛选出26 条引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。根据公司提供的引物的Tm 值，设定合适的退火温度，具体信息如表2。

表2 ISSR 引物信息Table 2 The ISSR primers used in this study

以提取的9 份栎属植物的DNA 为PCR 反应的模板，分别用26 条引物进行产物扩增。PCR 反应体系共25.0 μL，包括栎属植物DNA 0.5 μL、ISSR 引物2.0 μL、rTaq 酶12.5 μL。反应体系中的rTaq Mix 为预混型rTaq 酶（日本，Takara），其中包含了DNA 聚合酶、Mg2+、反应缓冲液、dNTP 等成分。ISSR-PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，依据表5 中的Tm 值退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 扩增产物用质量分数为1.5% 的琼脂糖凝胶进行电泳分离，恒压135 V 电泳35 min，在紫外凝胶成像系统中观察电泳条带并拍照。每个样品的PCR 扩增至少进行3 次重复，以减少误差。

1.3 数据统计分析

电泳条带记录时，用数字“1”表示电泳图中某孔道在该行中存在条带，用数字“0”表示电泳图中某孔道在该行中不存在条带。根据条带统计结果，用分析软件NTsys-pc 2.10e 计算9 种栎属植物之间的遗传相似系数，并基于遗传相似系数进行聚类分析，聚类方法选用UPGMA。

2 结果与分析

2.1 9 种栎属植物的ISSR 扩增结果

用26 条ISSR 引物（见表2）对9 种栎属植物的基因组DNA进行PCR扩增。经过琼脂糖凝胶电泳检测后，共筛选出23 条扩增条带清晰、多态性高的ISSR 引物。以4 号引物UBC-810 所扩增结果为例，9 种栎属植物在该引物扩增位点的多态性较高，共扩增出18 条电泳条带，其中多态性条带有17 条，多态性条带百分率达94.44%（图1），初步显示了9 种栎属植物间的遗传差异。

图1 9 种栎属植物的ISSR 扩增结果（以4 号引物UBC-810 为例）Figure 1 ISSR amplification bands of the introduced nine species of Quercus (primer: UBC-810)

2.2 9 种栎属植物的ISSR 遗传多样性

以扩增条带清晰、多态性高的23 条ISSR 引物进行9 种栎属植物间的遗传多样性分析，发现23 条引物共扩增出319 条条带，除UBC-879 仅扩增出3 条条带以外，其它每条引物至少扩增出了9 条条带，其中引物UBC-845 扩增出的条带数最多（为20 条），平均每个引物扩增出13.87 条条带。在319 条扩增条带中，298 条为多态性条带，平均多态性条带百分率为93.42%。在23 条引物中，多态性条带百分率最低的为66.67%（3 号引物），最高的为100%（共有11 条引物）（表3），表明这9种栎属植物的遗传多样性较为丰富。

表3 9 种栎属植物在23 条ISSR 引物位点上的扩增条带统计Table 3 Bands amplified by the 23 ISSR polymorphic primers of nine introduced species of Quercus

2.3 9 种栎属植物的亲缘关系分析

从9 种栎属植物的遗传相似系数分析结果可以看出，除了Q6 (‘沼泽白橡木’)与其它栎属植物的遗传相似系数在0.485 9～0.558 0 外，其它8 种栎属植物互相之间的遗传相似系数都在0.605 0～0.764 9（表4）。由此可以说明‘沼泽白橡木’与其它8 种栎属植物的亲缘关系最远。在9 种栎属植物中，遗传相似系数最大，即两个品种间亲缘关系最近的是Q9 (‘绿柱’)和Q4 (‘太平洋光辉’)，两者间的遗传相似系数为0.764 9，与其同属于沼生栎品种的客观事实相符。

表4 9 种栎属植物的遗传相似系数Table 4 Genetic similarity coefficients of the nine introduced species of Quercus

根据遗传相似系数对9 种栎属植物进行聚类分析，结果见图2。由图2 可知，在遗传相似系数0.650 处，9种栎属植物可分为3 类，其中3 个沼生栎品种（‘绿柱’‘太平洋光辉’和‘针栎’）和2 种娜塔栎种质（红叶娜塔栎和绿叶娜塔栎）被归为第一类，柳叶栎、‘猩红橡木’以及‘北方红橡’被归为第二类，而‘沼泽白橡木’单独归为第三类。在第一类中，‘绿柱’和‘太平洋光辉’沼生栎两者之间的亲缘关系最近。‘沼泽白橡木’和其它8 种栎属植物的亲缘关系最远。

图2 基于遗传相似系数的9 种栎属植物UPGMA 聚类Figure 2 UPGMA dendrogram of the nine introduced species of Quercus based on genetic similarity coefficients

3 结论与讨论

栎属植物具有重要的开发利用价值[18-19]。世界上的栎属植物约有300 种，我国仅有51 种，因此，引进并合理开发利用国外优良栎属种质资源对于丰富我国栎属种质资源并促进其开发利用具有重要意义。近年来，我国从国外引进了一些栎属植物资源，但对其开发利用水平有限。充分利用国外优良栎属种质资源的优势提升我国栎属植物的遗传改良水平对于促进我国栎属植物的开发利用具有积极影响。了解国外引进栎属植物的相对亲缘关系和遗传多样性，是将其应用到我国栎属植物遗传改良进程中的基础性工作。

分子标记技术是对植物种质资源进行亲缘关系分析和遗传多样性评价的有效技术手段。在多种分子标记中，ISSR 分子标记是最简便有效的分子标记之一，被广泛应用于辅助选育[20]、品种鉴定[21]、种质资源评价、遗传多样性研究[22]、遗传图谱构建[23]以及亲缘关系分析[24]等多个方面。ISSR 分子标记在多个物种的亲缘关系分析和遗传多样性分析上具有广泛应用。王志清[25]等采用ISSR 标记分析了61 份细辛Asarum sieboldii种质的遗传多样性，其多态性条带的比例为86.3%。原勤勤等[26]对38 个优良枣Ziziphus jujuba品种进行了亲缘关系分析，发现品种间的亲缘关系与地理位置密切相关。宁静等[27]对110 个株系的黄金茶Camellia sinensis‘Huangjincha’ 进行了亲缘关系分析和遗传多样性分析，共获得187 个多态性条带，多态率高达91.22%，并在遗传相似系数平均值0.55处，将黄金茶分为7 个类群。严华[28]等利用ISSR 分子标记对38 个品种的国兰（兰科Orchidaceae 兰属Cymbidium植物）进行了亲缘关系分析，得出的亲缘关系聚类图与传统分类的结果基本一致，并选用其中两个品种进行杂交实验，获得其成形的干果。由此也说明了ISSR 分子标记在亲缘关系分析、遗传多样性评价、指导植物辅助育种等方面具有一定的可行性。

本研究选用23 条ISSR 引物，利用PCR 技术对9 种国外引种的栎属植物进行遗传多样性分析和亲缘关系分析，共扩增出298 条多态性条带，其多态性条带比例达93.42%，其中扩增出多态性条带的比率为100%的引物有11 条，表明这9 种栎属植物的遗传多样性较高。禹靓倩等对27 种栎属树种亲缘关系的分析发现，利用12 条ISSR 引物扩增出140 个位点，其中多态性位点比率为82.14%[12]。本文研究结果发现基于ISSR 分子标记的栎属植物的多态性条带比率均超过80%，显示了所研究的栎属植物具有较高的遗传多样性；同时，本文研究的9 种国外引进栎属植物的多态性条带比例为93.42%，显著高于前人对27 种栎属树种的研究，显示了国外引进的9种栎属植物的较高遗传多样性，这也为其在国内栎属植物遗传改良中的应用奠定了坚实的材料基础。

本研究利用ISSR分子标记，从分子水平上揭示9种国外引进的栎属植物的亲缘关系。从遗传相似系数来看，在遗传相似系数为0.650 处，可将9 种栎属植物分为3 类，其中‘沼泽白橡木’和其它8 种栎属植物的亲缘关系最远，而3 种沼生栎（‘绿柱’‘太平洋光辉’和‘针栎’）之间的亲缘关系最近，ISSR 亲缘分析聚类结果与传统分类结果相似。从表型特征上看，‘绿柱’‘太平洋光辉’和‘针栎’三者的树形、秋色、树高等表型特征较为接近，但仍能在分子水平上检测出它们之间的差别，说明根据形态学特征，个体之间没有较大差异的品种，利用ISSR 标记仍能鉴别出其在分子水平上的差别。但值得注意的是，2 个娜塔栎种质的表型特征相近，最显著的区别仅为叶色，但从分子水平上看，绿叶娜塔栎种质与3 个沼生栎品种的亲缘关系更近。因此，不能仅仅依据物种的表型特征来判断物种之间的亲缘关系。建议对于亲缘关系的分析，应该结合分子标记、形态学标记等多种遗传标记综合考虑，进而分析确定物种以及品种之间的亲缘关系。当然，当前的分类结果是基于少数ISSR 位点的多态性，通量较低，可能对亲缘分析结果有一定的影响，未来可应用更多的标记进行进一步分析。在未来育种过程中，参考本文的分析结果，利用亲缘关系较远的品种进行杂交可创造更为优良的种质资源，从而保证育种群体的遗传多样性，促进栎属植物应用的可持续发展。