李博，赵强子，黎建军

（武汉科技大学附属普仁医院/武汉市普仁医院普通外科，湖北武汉430081）

胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的癌症，根据解剖位置可分为肝内、肝外和肝门部胆管癌[1]。尽管胆管癌是一种少见的癌症，但近几十年来，其发病率和病死率在全球范围内迅速增加[2]。胆管癌恶性程度高，手术是唯一有效的治疗方法，但只有15%的胆管癌患者接受手术治疗[3]。胆管癌患者确诊后的总生存时间仅6~24个月，胆管癌患者术后中位生存时间为27~36个月[4]。鉴于此，探讨胆管癌发病的分子机制对明确诊断及改善预后尤为重要[5]。长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于200个核苷酸不编码蛋白质的RNA，其是癌症细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、自噬和耐药性等细胞生物学过程中的关键调控因子[6-7]。lncRNA MCM3AP-AS1 （MCM3 AP-AS1）是最新发现的lncRNA。在原发性肝细胞癌[8]、乳腺癌[9]中上调表达，并调控癌细胞增殖和侵袭等过程。尽管如此，MCM3AP-AS1 在胆管癌中的表达、功能及作用机制尚知之甚少。本研究旨在胆管癌细胞系中研究MCM3AP-AS1 的表达及对细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其余Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导子和转录活化子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 信号通路以及上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

胆管癌细胞株（CCLP、 RBE、 9810、HuCCT1）及人肝内胆管上皮细胞株HIBEC（普诺赛公司，中国武汉）、RPMI-1640 培养基（Gibco 公司，美国）、TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific 公司）、Nano Drop ND-1000 紫外/可见光度计（Thermo Fisher Scientific 公司）、蛋白印迹试剂盒（上海碧云天生物公司）、MTT 细胞增殖试剂盒（日本Dojindo公司）、Transwell 试剂盒（中国Corning 公司）、E-cadherin 一抗（美国Santa Cruz 公司）、vimentin 一抗（美国cell signaling 公司）、STAT3 及p-STAT3 一抗（美国BD 公司）、JAK1/2 及p-JAK1/2 一抗（美国abcam 公司）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF） 购自美国Sigma 公 司、GAPDH 一 抗（武汉博士德生物公司）、羊抗兔二抗（武汉博士德生物公司）、Lipofectamine™3000 转染试剂购自美国Thermo Scientific 公司、qRT-PCR SuperMix 试剂盒购自碧云天生物公司。MCM3AP-AS1 引物序列由上海生物工程技术有限公司设计并合成，针对MCM3AP-AS1 设计的短干扰RNA（siRNA） 和其阴性对照序列（MCM3AP-AS1 无义序列）均由上海生物工程技术有限公司提供，序列正向：5'-CCC TCA GGT GAC TAC AGA T-3'，反向：5'-GCA ACA TGC TTC ACT GTCT-3'。MCM3AP-AS1 对照无义序列为5'-GAG CAG ATA GCT GAA GAG AGA-3'。

1.2 细胞培养及分组

胆管癌细胞株 （CCLP、 RBE、 9810、HuCCT1）及HIBEC 均培养于含胎牛血清的培养基中，并在37℃、5% CO2条件下培养。对CCLP 细胞系添加5 μL Lipofectamine™3000 转染试剂，分别转染MCM3AP-AS1 短干扰RNA（siRNA）和阴性对照序列（MCM3AP-AS1 无义序列），并分成MCM3APAS1 沉默组和阴性对照组，培养6 h 后，测定转染效率。后期功能拯救实验中，在MCM3AP-AS1 沉默组中加入JAK/STAT3 通路激动剂LIF，CCLP 细胞依此分为3 组：阴性对照组、MCM3AP-AS1 沉默组和MCM3AP-AS1 沉 默+LIF 组。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

采用TRIzol 试剂盒分别从各组细胞中提取总RNA。Nano Drop ND-1000 紫外/可见光度计用于评估RNA 纯度。 使用实时PCR 仪器测定各组MCM3AP-AS1 相对表达量。MCM3AP-AS1 qRT-PCR引物序列正向：5'-CAC ACG CAT GGA AAA CCC AG-3'，反向：5'-GAG GAC CTG AGC TGT AAG CC-3'，内参GAPDH 引物序列正向：5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3'，反向：5'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3'。2-ΔΔCT法用于计算MCM3AP-AS1 相对表达量，每次实验重复3 次，取平均值。

1.4 MTT法检测细胞增殖

MTT 实验用于评估细胞增殖能力，先将MCM3AP-AS1 沉默组和阴性对照组培养于96 孔板中（3×103/孔），然后在0、24、48、72 h 后加入100 μL MTT 试剂，在DYNEX MUM 酶标仪下测定每组在490 nm 处的吸光度值（A490 nm）。后期拯救实验中，在MCM3AP-AS1 沉默组、阴性对照组及MCM3AP-AS1 沉默+LIF 组中分别加入100 μL MTT 试剂，并测定A490 nm 值。绘制细胞增殖曲线。

1.5 Transwell实验测定细胞侵袭能力

细胞侵袭能力评估采用Transwell 实验，实验前将20 μL 混合液（1∶8 matrigel 胶:培养基）添加至上室，在37 ℃下保持30 min，然后将200 μL 无FBS 培养基的4×104个细胞填于上室，700 μL 10%FBS 培养基填于下室，然后按每组1×105个细胞加入上室，37 ℃孵育48 h 后，结晶紫染色并在倒置显微镜下计数穿膜细胞数，每次实验重复3 次，取均值。

1.6 Western blot测定蛋白表达量

将MCM3AP-AS1 沉默组和阴性对照组细胞培养至对数期后，裂解细胞并加入蛋白酶抑制剂，将蛋白沸水中高温变性，测定蛋白浓度，并按60 μg/孔蛋白样品上样电泳，恒压80 V 30 min，100 V 2 h，溴酚蓝跑到底即可。随后，切胶并转膜至PVDF膜。在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h 后，在4 ℃下分别与E-cadherin 一抗（1∶300）、vimentin 一抗（1∶200）、STAT3 及p-STAT3 一抗（1∶400）、JAK1/2 及p-JAK1/2 一抗（1∶300）、GAPDH 一抗（1∶400）在4 ℃下孵育过夜，用TBST 缓冲液漂洗10 min，漂洗3 次。加入羊抗鼠二抗（1∶900）在室温下孵育1 h，随后用TBST 缓冲液漂洗10 min，漂洗3 次。加ECL 液至PVDF 膜上，在暗室下曝光，用Image J软件计算目标条带的灰度值，目的蛋白表达量=目的条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.7 统计学处理

使用Prism Graphpad 8.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，在有统计学意义的基础上，两组间的比较采用LSD-T检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MCM3AP-AS1在胆管癌细胞系中上调表达

qRT-PCR 结果示，胆管癌细胞系CCLP、RBE、9810 及HuCCT1 中MCM3AP-AS1 表达量分别为7.1±0.4、 6.8±0.4、 6.6±0.2 及 6.4±0.3， HIBEC 中MCM3AP-AS1 表达量为1.5±0.2，胆管癌细胞系CCLP、RBE、9810 及HuCCT1 中MCM3AP-AS1 表 达量高于HIBEC（均P<0.05）（图1），本研究采用胆管癌细胞系CCLP 行后续功能实验。

图1 MCM3AP-AS1 在胆管癌细胞系和正常肝内胆管上皮细胞系中的表达比较Figure 1 Comparison of the expressions of MCM3AP-AS1 in cholangiocarcinoma cell lines and normal intrahepatic bile duct epithelial cell line

2.2 下调MCM3AP-AS1 表达对胆管癌细胞增殖的影响

qRT-PCR 结果显示，CCLP 细胞系转染siRNAMCM3AP-AS1 后，MCM3AP-AS1 沉默组的MCM3APAS1 表达量低于阴性对照组（1.8±0.1vs.7.1±0.3，P<0.05），提示转染成功，可行后续实验（图2A）。MTT 实验结果显示，下调MCM3AP-AS1 表达后，MCM3AP-AS1沉默组在转染后24、 48、 72 h，A490 nm值低于阴性对照组（均P<0.05）（图2B）。

图2 下调MCM3AP-AS1 表达对胆管癌细胞增殖的影响 A：MCM3AP-AS1 沉默效率测定；B：阴性对照组与MCM3APAS1沉默组增殖曲线比较Figure 2 The effect of down-regulation of MCM3AP-AS1 expression on the proliferation of cholangiocarcinoma cells A: MCM3AP-AS1 silencing efficiency assay; B: Comparison of the proliferation curves between negative control group and MCM3AP-AS1 silencing group

2.3 下调MCM3AP-AS1 表达对胆管癌细胞侵袭的影响

Transwell 实验结果显示，MCM3AP-AS1 沉默组的侵袭细胞数为140.3±10.2，阴性对照组侵袭细胞数为270.3±11.4，MCM3AP-AS1 沉默组的侵袭细胞数少于阴性对照组（P<0.05）（图3）。

图3 下调MCM3AP-AS1 表达对胆管癌细胞侵袭的影响 A：MCM3AP-AS1 沉默组与阴性对照组的Transwell 实验比较；B：MCM3AP-AS1沉默组与阴性对照组侵袭细胞数比较Figure 3 The effect of down-regulation of MCM3AP-AS1 expression on the invasion of cholangiocarcinoma cells A:Comparison of Transwell assay between MCM3AP-AS1 silencing group and negative control group;B:Comparison of the number of invasive cells between MCM3AP-AS1 silencing group and negative control group

2.4 下调MCM3AP-AS1 表达对胆管癌细胞JAK/STAT信号通路及EMT蛋白的影响

Western blot 结果显示，MCM3AP-AS1 沉默组STAT3 表达量与阴性对照组差异无统计学意义（1.32±0.11vs. 1.32±0.12，P>0.05），MCM3AP-AS1沉默组p-STAT3 表达量低于阴性对照组（0.51±0.07vs. 1.80±0.12，P<0.05）。MCM3AP-AS1沉默组JAK1/2 表达量与阴性对照组差异无统计学意义（1.27±0.16vs. 1.22±0.13，P>0.05），MCM3AP-AS1沉默组p-JAK1/2 表达量低于阴性对照组（0.64±0.08vs. 1.91±0.19，P<0.05）。MCM3AP-AS1 沉默组E-cadherin 表达量高于阴性对照组（1.81±0.04vs.0.42±0.03，P<0.05），MCM3AP-AS1 沉默组vimentin表达量低于阴性对照组（0.61±0.07vs. 1.41±0.17，P<0.05）（图4）。

图4 下调MCM3AP-AS1表达对胆管癌细JAK/STAT信号通路及EMT相关蛋白的影响 A：Western blot结果；B：蛋白表达量比较Figure 4 The effect of down-regulation of MCM3AP-AS1 on expressions of proteins associated with the JAK/STAT3 signaling pathway and EMT process in cholangiocarcinoma cells A: Western blot results; B: Comparison of the protein expression levels

2.5 JAK/STAT3通路激动剂LIF拯救实验对胆管癌细胞增殖的影响

MTT 实验示，转染后24、48、72 h，阴性对照组和MCM3AP-AS1 沉默+LIF 组A490 nm 值差异无统计学意义（均P>0.05），MCM3AP-AS1 沉默组A490 nm 值低于阴性对照组（均P<0.05）（图5）。

图5 各组不同时间点增殖能力的比较Figure 5 Comparison of proliferation abilities of three groups at different time points

2.6 JAK/STAT3通路激动剂LIF拯救实验对胆管癌细胞侵袭能力的影响

Transwell 实验示，阴性对照组和MCM3AP-AS1沉默+LIF 组侵袭细胞数差异无统计学意义[（270.4±10.8）个vs.（265.4±11.6）个，P>0.05]，MCM3APAS1 沉默组侵袭细胞数少于阴性对照组[（141.5±12.5）个vs.（270.4±10.8）个，P<0.05]（图6）。

图6 各组侵袭能力的比较 A：各组Transwell实验结果比较；B：各组侵袭细胞数比较Figure 6 Comparison of the invasion abilities among the three groups A:Comparison of the results of Transwell assay among the three groups;B:Comparison of the numbers of invasive cells among the three groups

3 讨 论

胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，具有症状隐匿、恶性程度高的特点，确诊时常处于中晚期，除手术治疗外，其他治疗方式疗效有限，预后差[10-12]。现代肿瘤学发现，肿癌的发生及进展涉及一系列关键分子的异常表达，包括lncRNA CBR3-AS1[13]、 lncRNA MCM3AP-AS1、lncRNA RP1-85F18.6[14]等。

MCM3AP-AS1 基因定位于人染色体6p22.3 位点上。文献报道MCM3AP-AS1 在多种肿瘤中起促癌基因的作用，在原发性肝细胞癌[8]中MCM3AP-AS1 表达水平上调，且可通过调控miR-194-5p/FOXA1 轴而促进癌症发生和进展；MCM3AP-AS1 在乳腺癌[9]中上调表达，并通过调节miR-28-5p/CENPF 轴促进癌细胞增殖和侵袭；在胶质母细胞瘤[15]中发现癌组织和体外培养的癌细胞系中MCM3AP-AS1 表达水平上调。本研究发现胆管癌细胞系中MCM3AP-AS1中表达水平显著高于HIBEC，这与文献[8-9]报道结果类似。进一步通过RNA 干扰技术沉默胆管癌细胞系中MCM3AP-AS1 表达水平，细胞功能实验发现MCM3AP-AS1 表达下调后，胆管癌细胞增殖和侵袭能力受到显著抑制，上述结果显示下调MCM3APAS1 表达水平可显著抑制胆管癌细胞的恶性行为。在甲状腺乳头状癌[16]中采用RNA 干扰技术沉默MCM3AP-AS1 表达水平后，体外培养的甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降，癌细胞凋亡比例增加。在胰腺癌[17]中，癌组织和癌细胞系中MCM3AP-AS1 表达水平上调，同时沉默MCM3APAS1 表达后胰腺癌细胞增殖和侵袭能力下降，且凋亡水平增加，其机制是MCM3AP-AS1 通过调控miR-138-5p 降低FOXK1 基因表达水平。在卵巢上皮细胞癌[18]中MCM3AP-AS1 表达水平上调后可通过调节miR-143-3p/TAK1 轴而促进癌症进展。综合文献报道和本研究结果，提示MCM3AP-AS1 在多种不同类型癌症中发挥癌基因功能，下调MCM3AP-AS1 表达可显著抑制癌细胞增殖和侵袭。

胆管癌细胞增殖和侵袭与细胞内信号通路激活密切相关[19]，目前已知JAK/STAT3 信号转导级联反应与胆管癌恶性进展密切相关，特别是STAT3 作为一种转录因子，可调节转移相关基因（如血管内皮生长因子）、细胞间黏附分子1 和基质金属蛋白酶9 表达，加速癌症侵袭和转移[20-21]。JAK/STAT3 信号通路是细胞因子信号传导的下游通路，调控细胞发育、增殖、凋亡及侵袭，是包括胆管癌在内的多种肿瘤发生和进展的关键信号通路[22-23]。文献[24]报道在胆管癌中膜联蛋白10 可促进EMT 和激活STAT3，进而促进癌症进展。在胆管癌中miR-490-3p 也可通过抑制STAT3/VEGFA 信号通路活性而抑制细胞增殖和血管生成[25]。事实上，lncRNA 和JAK/STAT3 关系密切，在结直肠癌[26]中下调lncRNA ITIH4-AS1 可抑制JAK/STAT3 信号通路从而抑制细胞增殖和侵袭，且可被JAK/STAT3 激动剂LIF 所拯救。在宫颈癌[27]中敲低lncRNA LINC00518可抑制JAK/STAT3 信号通路，从而抑制癌细胞增殖和转移。本研究探讨了胆管癌细胞系中MCM3APAS1 表达与JAK/STAT3 信号通路间的关系，结果显示下调MCM3AP-AS1 表达后磷酸化JAK1/2 和磷酸化-STAT3 蛋白表达水平显著降低，当加入LIF 后，可部分恢复下调MCM3AP-AS1 表达对胆管细胞癌细胞增殖和侵袭的抑制作用，这与结直肠癌及宫颈癌中的结果类似。

JAK/STAT3 与EMT 过程有着密切的调控关系。在TGF-β、IL-6 等细胞因子的刺激下，JAK-STAT3级联激活，STAT3 磷酸化及二聚体化，并进入到细胞核，激活EMT 过程的关键转录因子Snail、Zeb1及Twist-1，并最终导致EMT 的发生[28]。目前公认EMT 过程在胆管癌发生和进展过程发挥关键作用，EMT 过程赋予细胞迁移和侵袭能力，其中EMT 过程中间质相关蛋白过度表达是促进胆管癌进展和转移的重要驱动因素，也是反映胆管癌不良预后的重要因素[29]。文献[30]报道在非小细胞肺癌中，通过上调MCM3AP-AS1 表达可显著促进EMT 过程，加速癌细胞增殖和侵袭，抑制凋亡，且这种作用可通过上调miR-195-5p 表达而逆转，即下调MCM3APAS1 表达后，体外培养的A549 细胞EMT 过程受到抑制，癌细胞凋亡比例增加。上述结果提示MCM3AP-AS1 可调控EMT 过程而参与癌细胞恶性行为。本研究结果也发现下调MCM3AP-AS1 后可抑制胆管癌EMT 过程，即上皮相关蛋白E-cadherin 表达水平增加，而间质相关蛋白vimentin 表达水平下降，沉默MCM3AP-AS1 表达进而抑制胆管癌侵袭过程可能与EMT 过程受抑制有关。

由于本研究只是体外研究，不可避免存在一定的不足，首先，MCM3AP-AS1 在胆管癌组织中的表达及预后价值值得进一步研究； 其次，MCM3AP-AS1 在模式动物中的功能也值得深入研究；最后，本研究只在功能上研究了加入LIF 后细胞增殖和侵袭功能的改变，未在通路蛋白水平上进一步研究，这仍需进一步深入。

综上所述，MCM3AP-AS1 在胆管癌细胞表达上调并发挥致癌基因功能，下调MCM3AP-AS1 表达可通过抑制EMT 和JAK/STAT3 信号通路活性而抑制细胞增殖和侵袭，下调MCM3AP-AS1 表达可能有望成为胆管癌治疗的新策略。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。