响应面法优化椰蓉饲料发酵工艺及品质评定

2022-09-01吴军龙张晓梦王闫宇张海文李笑春王学梅曹春雷

饲料工业 2022年16期

■吴军龙张晓梦王闫宇张海文李笑春王学梅* 曹春雷

（1.海南大学动物科技学院，海南海口 570228；2.广西科胜生物科技有限公司，广西崇左 532200）

近年来，玉米、豆粕等饲料资源紧缺并且价格上涨[1]，粗饲料等非常规饲料资源的开发得到越来越多的关注。饲料资源受到制约从而影响畜牧业发展，微生物发酵饲料产业的发展是解决饲料短缺的重要途径之一[2]，同时也使得地源性资源成为研究的热点[3]。椰蓉（coconut residue, CR）是椰肉经榨汁后剩余的部分，含有脂肪、蛋白质及大量的纤维素，椰蓉中油脂是一种植物性饱和油脂，其含有80%饱和脂肪酸以及20%不饱和脂肪酸[4]，其中月桂酸含量为60%[5]，己酸、辛酸、癸酸含量不超过20%，是制备低碳脂肪酸的原料来源之一[6]。椰子是海南特色热带木本油料作物，2017年椰子产量高达到2.33亿个以上，而椰蓉作为一种食品加工副产物，具有很大的饲料开发应用潜力和很高的经济价值，但因新鲜椰蓉水分和脂肪含量高，一般为干物质的30%左右，有的甚至更高（因椰子来源不同而有差异），不易保存，容易氧化酸败，因此如何延长椰蓉保存期、避免氧化酸败成为椰蓉利用考虑的重点。

发酵饲料是在人为可控制的条件下，利用微生物通过发酵降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质[7-8]，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料，其有效成分包括菌体蛋白、酶类、生物活性小肽类、氨基酸、有机酸、活性益生菌等。发酵处理不仅可以通过降低抗营养因子和分解毒素等来改善饲料品质、提高饲料的消化利用率、延长饲料保存期，还能通过调节动物体内的微生态平衡，达到促生长、抗腹泻、增强机体免疫力等作用[8-9]。发酵品质的优劣受菌种、发酵底物、发酵温度、水分、溶氧量等及发酵工艺等多种因素的影响。

本试验以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）为发酵菌种，椰蓉和豆粕作为发酵底物，采用两步固态发酵方式，即先利用酿酒酵母和枯草芽孢杆菌复合菌种进行有氧发酵，再加入植物乳杆菌进行厌氧发酵，通过中心组合设计（Box-Behnken Design，BBD）优化发酵条件，以提高椰蓉发酵饲料的营养价值，改善其感官品质，并能够达到较长时间保存椰蓉、更好地作为饲料原料利用的目的。该研究可为海南椰蓉生产高品质畜禽饲料的开发与利用提供参考，为海南地源性饲料的研究与开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 椰蓉、菌种

椰蓉购于海南某椰子加工厂，豆粕购于海南省海口市粮油市场。酿酒酵母、植物乳杆菌使用海南大学热带动物繁育与营养实验室分离的菌株。枯草芽孢杆菌由海南大学热带动物繁育与营养实验室提供。

1.1.2 药品与试剂

枯草芽孢杆菌：选用LB液体培养基，置于37 ℃，150 r/min 恒温摇床培养12 h，活菌数达到约1.93×108CFU/mL，备用。

酿酒酵母菌：选用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD 液体培养基），置于28 ℃，恒温250 r/min 摇床，培养12 h，活菌数达到约1.93×108CFU/mL，备用。

植物乳杆菌：选用乳酸细菌液体培养基（MRS 液体培养基），置于37 ℃，厌氧、静置培养12 h，活菌数达到约2.7×109CFU/mL，备用。

1.2 方法

1.2.1 Box-Behnken试验设计

采用Design Exper 8.0 软件进行Box-Behnken Design（BBD）对微生物发酵椰蓉的影响显著因子进行优化，结合因素效应和试验中的实际情况。各因素及水平见表1和表2。

表1 BBD试验设计因素水平

表2 BBD试验设计

1.2.2 发酵试验设计

通过表1 的BBD 试验设计，设置17 个处理（见表2）。椰蓉和豆粕配比为1∶1，每个处理设置3个重复，每个重复2 个平行。采用两步固态发酵方式，先利用酿酒酵母和枯草芽孢杆菌复合菌进行有氧发酵3、5 d，再加入植物乳杆菌进行厌氧发酵5、10、15 d，在有氧发酵阶段每2 h翻动1次底物，见表3。

表3 发酵条件试验设计

1.3 检测指标及方法

1.3.1 感官评定方法及标准

参照GB/T 10220—2012感官分析方法学总论[10]、GB/T 21172—2007 感官分析食品颜色评价的总则和检验方法[11]，并结合椰蓉发酵的预试验制定了发酵椰蓉饲料感官评定标准，如表4所示。

1.3.2 常规养分

参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[12]，测定粗蛋白（CP，采用凯氏定氮法进行测定）、粗灰分（CA，采用灰化法进行测定）、粗脂肪（EE，采用粗脂肪测定仪测定）、粗纤维（CF，采用纤维仪测定）、中性洗涤纤维（NDF，采用纤维仪测定）、酸性洗涤纤维（ADF，采用纤维仪测定）、总能（GE，采用氧弹量热仪测定）、水分及干物质（DM，采用烘箱干燥法测定）含量。

1.3.3 pH

取10 g 的发酵饲料样品放入装有90 mL 无菌水的锥形瓶中，搅拌均匀，置于4 ℃冰箱冷藏过夜，用pH计进行测定。

1.3.4 饲料卫生指标

参照GB 13078—2017《饲料卫生标准》[13]。发酵饲料中大肠杆菌用麦康凯培养基培养平板计数法检测。发酵饲料中沙门氏菌用SS培养基培养平板计数法检测。发酵黄曲霉毒素B1采用酶联免疫分析试剂盒（江苏科特生物科技有限公司），按说明书进行检测。

1.4 数据分析

试验数据首先采用Excel 2010进行初步整理，利用SAS 9.2 软件进行单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 原料的营养成分分析及pH（见表5）

发酵前椰蓉、豆粕及椰蓉与豆粕混合物的常规养分和pH测定结果见表5。为后续发酵试验提供参考。

2.2 发酵饲料的品质评定

2.2.1 发酵饲料感官品质评定（见表6）

由表6可知，通过颜色、气味、质地等感官指标对椰蓉发酵饲料品质进行评定，结果显示在有氧发酵阶段发酵饲料颜色和质地方面没有明显差异，但是在气味上差异明显，处理1最好，其次是处理13，综合颜色、气味和质地判断有氧发酵3 d的饲料品质整体优于有氧发酵5 d。在厌氧发酵阶段发酵饲料颜色变化不大，评分均在良好以上，综合气味和质地以发酵10 d为最佳。从整个发酵期的感官评分来看，均没有粘连和结块等现象出现，综合评分仍以处理1和处理13为最优。

表6 发酵饲料感官评定的结果

2.2.2 发酵饲料常规养分及pH（见表7、表8）

在感官评分结果的基础上，对有氧发酵3 d 和厌氧发酵10 d的饲料进行常规养分及pH的检测，试验结果见表7 和表8。椰蓉与豆粕混合物经过发酵，其水分、粗蛋白、粗脂肪及pH各组间存在不同程度的差异。

有氧发酵3 d，发酵饲料中粗蛋白水平处理1 组最高，且与处理2、3、4、11 和处理14 差异不显著（P＞0.05），与其他组间差异显著（P＜0.05）；处理12显著低于其他处理组（P＜0.05），处理6、8、17 间差异不显著（P＞0.05），但与其他处理差异显著（P＜0.05）。在有氧发酵3 d的基础上再持续厌氧发酵10 d后，处理13的粗蛋白水平最高，且与处理1、2、3、5 差异不显著（P＞0.05），与其他处理组差异显著（P＜0.05）；处理9、11、12 粗蛋白水平较低，且三者之间差异不显著（P＞0.05），与其他处理组差异显著（P＜0.05）。

由表7 和表8 可知，对于发酵饲料pH 来说，有氧发酵3 d 处理6 的pH 最高，与处理1、7、13、16 差异显著（P＜0.05），与其他处理组差异不显著（P＜0.05）。在有氧发酵3 d 的基础上再持续厌氧发酵10 d 后处理1、13的pH显著低于其他处理组（P＜0.05）。

表7 有氧发酵3 d椰蓉发酵饲料常规养分及pH

表8 有氧发酵3 d再持续厌氧发酵10 d椰蓉发酵饲料常规养分及pH

有氧发酵3 d，处理1、5、6、13、15、17间粗脂肪水平差异不显著（P＞0.05），而处理6、13、17 粗脂肪含量显著高于其他处理组（P＜0.05）；在有氧发酵3 d 的基础上再持续厌氧发酵10 d后处理4、17粗脂肪含量显著低于其他处理组（P＜0.05），二者间差异也显著（P＜0.05）；处理2 与处理1、5、7、10、14、16 间差异不显著（P＞0.05），与其他处理差异显著（P＜0.05）。

由表7和表8可知，有氧发酵3 d后处理6、12、17中水分含量显著低于其他处理组（P＜0.05），但3 组间差异不显著（P＞0.05）；处理4、5、7、8、10、14、16间差异不显著（P＞0.05），与处理1、2、3、9、11、13、15差异显著（P＜0.05）。在有氧发酵3 d的基础上再持续厌氧发酵10 d后，各处理水分含量变异加大，处理13水分含量最高且与其他处理组差异显著（P＜0.05），处理7、12、14、16间差异不显著（P＞0.05）。

2.2.3 卫生指标（见表9和表10）

表9 沙门氏菌和大肠杆菌的检测结果

由表9和表10可知，在整个发酵过程中均未检测出沙门氏菌和大肠杆菌。国家关于豆粕黄曲霉毒素B1的含量最高限量为30 μg/kg，本试验中各处理组发酵椰蓉黄曲霉毒素含量均未超标。

表10 黄曲霉毒素B1酶联免疫检测结果（μg/kg）

2.2.4 椰蓉发酵饲料粗蛋白的Box-Behnken Design结果

2.2.4.1 粗蛋白二元回归方程的方差分析结果（见表11～表13）

表11 BBD试验设计及结果

经回归拟合后，得到以粗蛋白（Y1）为响应值的回归方程。

Y1=33.12+0.28A-1.40B-0.55C-0.95AB-3.91AC-1.54BC-2.83A2+0.021B2-0.82C2

由表12可知，模型的P＜0.05，表明该模型二次方显著，失拟项不显著（P=0.060 2），表明了模型中并没有异常数据。从表13 可知，回归方程复相关系数为0.902 5，校正相关系数为0.777 3，变异系数为4.53%，信噪比为8.651，说明该回归方程拟合程度良好。各因素对粗蛋白影响大小顺序：水分含量＞菌种比＞菌种添加量。通过对回归方程的方差分析得出：一次项B显著（P＜0.05），A、C不显著（P＞0.05），二次项A2极显著（P＜0.01），B2、C2不显著（P＞0.05），交互项AC极显著（P＜0.01），AB、BC不显著（P＞0.05），说明该回归方程能够很好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

表12 粗蛋白二元回归方程的各项方差分析结果

表13 粗蛋白方差分析结果

2.2.4.2 椰蓉发酵饲料的粗蛋白最优条件确定和模型验证（见图1～图3）

为了对粗蛋白结果有一个更加直观的理解，基于二次回归模型绘出影响饲料粗蛋白的等高线和三维图，三维图中出现椭圆意味着两个变量之间具有较强的相互作用，说明各因素之间相互作用较大，三维图中出现圆形意味着两个变量之间相互作用不显著，说明各因素之间相互作用不大。

由图1可知，当菌种比为代码0时，随着菌种添加量的增加，粗蛋白先升高后有所降低，随着水分含量的增加，粗蛋白出现小幅度的降低，基本保持稳定。

图1 菌种添加量和水分含量交互作用对粗蛋白影响的响应面和等高线

由图2可知，当水分含量为代码0的时候，随着菌种比的增加，粗蛋白也随之增加。随着菌种添加量的增加，粗蛋白随之增加。

图2 菌种添加量和菌种比交互作用对粗蛋白影响的响应面和等高线

由图3可知，当菌种添加量为代码0时，随着菌种比的增加，粗蛋白也增加。随着水分含量的增加，粗蛋白随之增加。

图3 水分含量和菌种比交互作用对粗蛋白影响的响应面和等高线

2.2.5 椰蓉发酵饲料粗脂肪的Box-Behnken Design结果

2.2.5.1 粗脂肪二元回归方程的方差分析结果（见表14、表15）

经回归拟合后，得到以粗脂肪（Y2）为响应值的回归方程。

Y2=28.52+0.16A-0.2B-0.51C-0.44AB+0.37AC-1.00BC+0.32A2+0.72B2-0.49C2

由表14和表15可知，模型的P＜0.01，表明该模型二次方极显著，失拟项不显著（P=0.320 0），表明了模型中并没有异常数据，从表15可知，回归方程复相关系数为0.924 5，校正相关系数为0.827 5，变异系数为1.28%，信噪比为12.088，说明该回归方程拟合程度良好。各因素对粗脂肪的影响大小顺序：菌种比＞水分含量＞菌种添加量。通过对回归方程的方差分析得出：一次项C极显著（P＜0.01），A、B不显著，二次项B2极显著（P＜0.01），C2显著（P＜0.05），A2不显著（P＞0.05），交互项AB显著（P＜0.05），BC极显著（P＜0.01），AC不显著（P＞0.05），说明该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

表14 粗脂肪二元回归方程的方差分析结果

表15 粗脂肪方差分析结果

2.2.5.2 椰蓉发酵饲料的粗脂肪最优条件确定和模型验证（见图4～图6）

图4 菌种添加量和水分含量交互作用对粗脂肪影响的响应面和等高线

图6 水分含量和菌种比交互作用对粗脂肪影响的响应面和等高线

为了对粗脂肪结果有一个更加直观的理解，基于二次回归模型绘出影响饲料粗脂肪的等高线和三维图。

由图4可知，当菌种比为代码0时，粗脂肪随着水分含量的增加出现先小幅度降低后增加，粗脂肪随着菌种添加量的增加而增加，等高线图为椭圆，说明菌种添加量和水分含量互作显著。

由图5可知，当水分含量为代码0时，粗脂肪随着菌种比例的升高而降低。随着菌种添加量的增加，粗脂肪减少趋势平缓不明显，有小幅度的减少。

图5 菌种添加量和菌种比交互作用对粗脂肪影响的响应面和等高线

由图6可知，当菌种添加量为代码0时，随着菌种比的增加，粗脂肪也随之增加。随着水分比例的升高，粗脂肪也随着升高。

根据软件Design-Expert 对椰蓉发酵饲料中的粗蛋白和粗脂肪的模型计算，选取模型中最优发酵条件，得出最佳菌种添加量为代码0.69，水分比例为代码-1，菌种比例为代码0.08，在此条件下粗蛋白含量为33.90%，粗脂肪含量为30.10%。为检验响应面方法所得结果的可靠性，采用上述优化发酵条件进行椰蓉饲料发酵，并考虑实际生产应用的不同条件下能耗的问题，将发酵工艺修正为：菌种添加量为代码1，水分含量为代码-1，菌种比为代码0，在此条件下重复3 次，实际测得粗蛋白含量为35.25%，粗脂肪含量为31.56%。因此，响应面模型所得的优化椰蓉发酵饲料工艺参数准确可靠，具有较好的生产与应用。

3 讨论

3.1 发酵椰蓉饲料感官评定

本试验整个发酵过程，采用两步固态发酵，即先利用酿酒酵母与枯草芽孢杆菌复合菌对发酵底物进行有氧发酵，然后在此基础上加入植物乳杆菌进行厌氧发酵。从颜色、气味和质地等感官指标评定，前期有氧发酵3 d整体优于有氧发酵5 d的处理；继续厌氧发酵10 d优于继续厌氧发酵5 d和15 d的处理。发酵时间是影响发酵品质的重要因素，有研究表明适宜的发酵时间不仅能够很好地消除饲料中的抗营养因子[14]，也不会因为发酵时间过长导致底物大部分营养物质被消耗、菌种生长过慢，并出现自溶现象[15]。或因发酵时间不足而导致发酵产率降低[16]，控制适宜的发酵时间既能保证发酵底物与菌体间的充分作用，又能避免发酵成本高的问题。综合本试验感官评定结果可知，有氧发酵3 d，再继续厌氧发酵10 d，发酵产物感官评价达到优。

3.2 发酵椰蓉饲料卫生指标及pH

本试验中无论有氧还是厌氧对发酵饲料pH都有显著影响。pH是评价发酵过程的重要指标[17]。pH升高的原因可能是因为芽孢杆菌在发酵过程中产生蛋白酶，降解发酵底物中的蛋白质产生胺类物质，甚至产生一些氨等物质使得产物pH 升高[18]，pH 降低的原因是乳酸菌在发酵过程中产生一些乳酸、乙酸等有机酸使发酵产物pH 降低[19]。改善饲料品质，可提高饲料适口性、风味和消化率[20]。同时，还能有效抑制致病菌生长，保证饲料的安全性，但是从椰蓉原料脂肪含量高的这一特点来说，既要有适当的乳酸积累，又要控制好酸度，酸度不能过低，否则会导致脂肪酸败，发酵品质下降。发酵条件控制得好坏是控制发酵饲料致病菌、毒素含量的关键，卫生指标也是评价发酵饲料品质的重要参考，本试验没有检测出沙门氏菌、大肠杆菌，并且黄曲霉毒素B1含量也符合国标要求。

3.3 水分对发酵椰蓉饲料品质的影响

发酵饲料最终的水分由底物原有的部分水、微生物代谢产生的水及发酵条件要求额外添加的水分构成。发酵底物水分含量是固态发酵成功与否的重要影响因素，水分含量过高影响耗氧微生物对空气的利用，但是能够增加菌体的生长，使得营养成分也增加[21]。如发酵底物的含水量过低，菌体生长受到抑制，使得耗氧微生物分解抗营养因子受到阻碍，导致产生活性酶能力降低。林标声等[22]在饲料中添加复合发酵菌剂（酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌）进行常规饲料的密封发酵，研究发现，发酵底物的含水量越高，微生物生长越快，发酵效果越好，选定最适含水量为34%～36%，既能保证微生物的快速生长，又能降低生产操作成本。本试验综合各项指标可知，采用复合菌种发酵椰蓉饲料的最佳含水量为36%～40%，这与前人研究结果一致[23-24]。

3.4 菌种比对发酵饲料影响

微生物-微生物的相互作用是复杂的，但被认为是获得所需产品特性的关键[25-26]。本试验在3种菌互作下，使发酵饲料具有浓郁的椰香味、醇香味及淡淡的酸香味，提高了椰蓉的风味。史玉宁等[27]利用啤酒酵母菌和乳酸菌为复合菌株发酵豆粕发现，接种量为10%，含水量为38%，啤酒酵母菌∶乳酸菌=2∶1，粗蛋白含量提高12.27%，发酵豆粕中的不良影响因子大大降低，动物适口性提高，有利于动物的消化与利用。本试验研究发现菌种添加比为（酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌）∶植物乳杆菌为（2∶2）∶1 和（2∶3）∶1时，椰蓉发酵饲料的蛋白质水平提高，pH 下降，风味得到改善，本试验研究与徐力等[28]研究一致。添加复合菌种能够将发酵底物中的大分子蛋白质分解成小分子蛋白质或者活性肽[29]。对豆粕的研究表明[30-31]，经过复合微生物发酵处理过的豆粕，能够降解发酵底物中的抗营养因子，还可以分解成利于动物消化吸收的营养物质和活性因子。乳酸菌和其他优势菌株的大量繁殖，一些细菌分泌具有脂肪酶活性的物质，使脂肪缓慢分解及发生氧化作用，生成与醛、酮、醇及短链脂肪酸等物质[32-34]，其挥发会导致总脂肪相对含量降低。发酵过程是菌种种类、比例、发酵条件、发酵底物特性等多因素综合作用的结果。

综上所述，发酵过程为有氧发酵3 d、厌氧发酵10 d，水分含量为36%、菌种添加量为10%、菌种比为：酵母菌∶枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌为（2∶2）∶1和水分含量为40%、菌种添加量为8%、酵母菌∶枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌为（2∶3）∶1，得到具有浓郁的椰香味、醇香味及淡淡的酸香味，颜色接近原料，质地松散的高品质发酵饲料。选取粗蛋白和粗脂肪作为响应值，通过响应面法对复合菌种发酵椰蓉饲料的工艺进行优化，可知最佳优化发酵条件为有氧发酵3 d同时厌氧发酵10 d，菌种添加量10%，水分含量为36%，菌种比为酿酒酵母菌∶枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌为（2∶2）∶1，该工艺下得到发酵椰蓉粗蛋白含量为35.25%，粗脂肪含量为31.56%。